1997年美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)公布了M27-A方案,即酵母菌的液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗標準方案,表明酵母菌的體外藥敏試驗已趨于標準化,而絲狀真菌藥敏試驗還在不斷發展。龙8娱乐官方网站以此方案中的微量法為基礎,探討并建立曲霉的標準化藥敏試驗方法。
一、材料和方法
1.試驗菌株來源:受試菌株31株:煙曲霉14株、黃曲霉8株、黑曲霉5株、構巢曲霉3株和土曲霉2株。試驗菌株由臨床株和環境株組成,主要由北京醫科大學第一醫院、中國科學院微生物研究所等提供。
2.抗真菌藥物包括:5-氟胞嘧啶(5-FC) 和兩性霉素B(AmB)由Sigma公司提供,氟康唑(FCZ)由三維制藥公司提供,酮康唑(KCZ)和伊曲康唑(ICZ)由楊森制藥公司提供,特比萘芬(TBF)由諾華制藥公司提供,貯存液的制備詳見參考文獻[1]。
3.培養基:RPMI-1640液體培養基,唯有TBF試驗用2%沙氏液體培養基(SDB)。
4.方法:參照NCCLS方案(1997年版)[2]進行,但有如下幾點說明。(1)TBF藥液制備:TBF貯存液用SDB稀釋,終濃度0.0313~16 μg/ml。(2)菌懸液制備:將受試菌株在麥芽培養基
三、結果
1、6種抗真菌藥物對31株曲霉的MIC值的幾何均數及MIC值范圍見表1。ICZ與TBF對31株曲霉的MIC值的幾何均數較低,ICZ僅對3株曲霉的MIC值≥1 μg/ml,其中對2株的MIC值為1 μg/ml,對1株的MIC值為2 μg/ml;TBF對4株曲霉菌的MIC值≥1 μg/ml,其中3株MIC值為1 μg/ml,對1株MIC值為2 μg/ml;AmB的MIC值集中在1 μg/ml或2 μg/ml,其中AmB對15株的MIC值>1 μg/ml,其中MIC值為2 μg/ml、4 μg/ml和8 μg/ml者分別為10株、3株和2株;KCZ對20株曲霉菌的MIC值>1 μg/ml;FCZ對12株曲霉菌的MIC值≥64 μg/ml;5-FC對20株曲霉菌的MIC值≥32 μg/ml,其中11株的MIC值為32 μg/ml,9株的MIC值≥64 μg/ml。
2.將6種藥物對曲霉菌的MIC值進行秩和檢驗,結果表明,ICZ和TBF對曲霉菌的MIC值均值明顯低于其他4種藥物(P<0.01)。
表1 6種抗真菌藥物對5種曲霉菌的MIC值幾何均數及范圍(μg/ml)
抗真菌藥 |
煙曲霉14 |
黃曲霉8 |
黑曲霉4 |
構巢霉3 |
土曲霉2 |
均值 |
MIC范圍 |
5-FC |
27.57 |
26.89 |
22.62 |
31.98 |
32.00 |
27.35 |
4~64 |
FCZ |
37.11 |
29.33 |
22.62 |
31.28 |
24.00 |
31.28 |
4~64 |
KCZ |
2.21 |
1.54 |
2.38 |
2.00 |
0.75 |
1.34 |
0.25~16 |
ICZ |
0.24 |
0.35 |
0.21 |
0.20 |
0.19 |
0.30 |
0.03~2 |
AmB |
1.41 |
1.83 |
0.19 |
1.02 |
0.75 |
1.17 |
0.25~8 |
TBF |
0.37 |
0.27 |
0.42 |
0.13 |
0.31 |
0.31 |
0.06~2 |
注:5-FC:5-氟胞嘧啶;FCZ:氟康唑;KCZ:酮康唑;ICZ:伊曲康唑;AmB:兩性霉素B;TBF:特比萘芬四、討論
目前絲狀真菌藥敏試驗的理想條件是:(1)接種濃度104CFU/ml;(2)孵育時間48~72小時;(3)終點判讀宜通過比色法,得到更為精確的MIC值[3,4]。
在試驗中,ICZ、TBF的MIC值較低,顯示曲霉菌對這兩種藥物高度敏感,其中MIC值≥1 μg/ml的菌株,ICZ僅有3株,TBF僅有4株。資料表明[5],臨床治療中發現的ICZ耐藥菌株,其MIC值≥16 μg/ml,而本試驗ICZ的MIC值全部小于16 μg/ml,說明目前國內曲霉菌株仍對ICZ高度敏感,尚未發現耐藥株;資料[6]表明,TBF對曲霉有較強的抑菌作用,其均值MIC50/MFC90為0.4~1.6 μg/ml,其耐藥標準與AmB相當,在與AmB、KCZ、5-FC相比的曲霉藥敏試驗中,其敏感性明顯高于這些藥物,表明TBF有可能用于曲霉病的治療。AmB和KCZ的MIC值較高,其中MIC值>1 μg/ml的菌株分別為15株和20株;對于5-FC和FCZ,依據M27-A方案念珠菌的耐藥標準,5-FC的MIC值≥32 μg/ml的菌株有20株,FCZ的MIC值≥64 μg/ml的菌株有12株,表明后4種藥物對曲霉的敏感性較差。值得說明的是,31株曲霉菌中AmB的MIC值>1 μg/ml有15株,而臨床工作中,AmB治療曲霉病有較好的療效[5],這一點可能恰好反映出M27-A方案本身對AmB的耐藥性檢測不敏感的問題。
志謝 本課題得到北京醫科大學第一臨床醫院諾華真菌研究中心的資助
參考文獻
[1] 王文莉,王端禮,李若瑜,等.酵母菌的NCCLS藥敏試驗方法及其應用.中華醫學檢驗雜志,1997,20:119-122.
[2] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard M27-A.
[3] Espinel-Ingroff A, Bartlett M, Bowden R, et al. Multicenter evaluation of proposed standardized procedure for antifungal susceptibility testing of f??ilamentous fungi. J Clin Microbiol,1997,35:139-143.
[4] 劉偉,李若瑜,王端禮.絲狀真菌藥敏試驗的研究進展.中華醫學檢驗雜志,1997,20:313-315.
[5] Denning DW,Venkateswarlu K, Oakley KL,et al. Itraconazole resistance ?in Aspergillus fumigatus. Antimicrob Agents Chemother,1997,41:1364-1368.
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