摘要: 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)分離株在仔豬腸道內增殖后收獲小腸組織提純并濃縮病毒,與弗氏佐劑乳化后免疫待開產蛋雞;同時將在Vero細胞中適應增殖的PEDV病毒提純濃縮后作為檢測抗原。利用瓊脂擴散試驗檢測免疫雞的血清抗體和卵黃抗體效價變化動態,結果顯示血清抗體較卵黃抗體出現早,提前1周到達峰值,同時其抗體效價下降也快。將抗體效價≥1:64的卵黃收集,經氯仿抽提和硫酸胺沉淀后制備提純卵黃抗體液,經SDS-PAGE電泳顯示該提純卵黃抗體主要由分子量分別為66kd的重鏈和35kd的輕鏈組成。攻毒治療試驗結果顯示卵黃抗體治療組和對照組死亡率分別為16.7%和100%,表明該卵黃抗體對豬流行性腹瀉病毒所致的仔豬腹瀉具有明顯的治療效果。
關鍵詞:豬流行性腹瀉病毒(PEDV), 卵黃抗體(IgY),仔豬腹瀉
豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)為冠狀病毒科的成員,與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)感染引起的臨床癥狀和病理變化極為相似,該病原可致各種年齡的豬發病,其特征癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水,本病呈地方流行性,仔豬有較高的發病率和死亡率,給某些養豬場豬場帶來嚴重經濟損失[1]。
對曾發生過該病的豬場或接種過PEDV弱毒疫苗的妊娠母豬,仔豬主要通過初乳獲得對PEDV的抵抗力,母源抗體消失后的斷奶仔豬常出現頑固性腹瀉,而一旦暴發豬流行性腹瀉,目前尚沒有特別有效的防治措施。鑒于卵黃抗體與初乳作用機理相似,都是通過被動免疫途徑達到對仔豬的保護,因而研制抗PEDV卵黃抗體[2],應用于發生PED的豬場,對防止PED的流行及降低該病造成的損失將具有重要意義。
本試驗利用一株豬流行性腹瀉病毒分離株,制備免疫原免疫產蛋雞,收集高效價卵黃,分離提純卵黃抗體,用于PED的治療和預防,從而為防治PED研制一種療效顯著、使用方便、易于大量獲得且無環境污染的生物制劑。
1材料和方法
1.1材料
1.2方法
2結果
2.1血清抗體和卵黃抗體效價檢測 結果顯示,二免后1周血清抗體較卵黃抗體效價高,血清抗體效價上升快,至三免后2周達到峰值,之后其效價快速下降;而卵黃抗體效價上升較慢,三免后3周達到峰值,之后其效價緩慢下降,較血清抗體維持2.2卵黃抗體濃度、純度和效價測定 卵黃經氯仿去脂后蛋白濃度為14.5mg/mL ,經硫酸胺沉淀并透析后蛋白濃度為10.2mg/mL;SDS-PAGE蛋白質電泳(圖2)顯示不同方法處理后卵黃抗體純度明顯提高,卵黃抗體由分子量約為66kd和35kd的重鏈和輕鏈組成,與文獻報道一致[7];氯仿去脂后瓊擴效價為1∶8,而透析后上升至1∶64。
2.3卵黃抗體抗病毒活性測定 攻毒后12-24小時所有仔豬均出現不同程度的黃色水瀉,治療組在口服卵黃抗體液后腹瀉癥狀逐漸減輕,4-5天后基本恢復正常,死亡率僅16.7%;而對照組腹瀉呈水樣噴射,死亡主要出現在攻毒后2-3天,死亡率為100%,兩者差異極顯著。結果見表1。
表1 仔豬攻毒治療后不同天數死亡情況及糞便指數結果
Tab.1 Comparison of mortality rate and fecal scoring between the IgY treatment group and the control group
&nb?sp; &nbs?p; ??  ??; |
1d |
2d |
3d |
4d |
5d |
死亡率 Mortality rate |
治療組 IgY treatment group |
12/12(2.3) |
10/10(2.0) |
6/10(0.6) |
2/10(0.2) |
0/10(0) |
16.7% |
對照組 control group |
6/6(3.0) |
4/4(3.0) |
1/1(3.0) |
0 |
0 |
100% |
注:分母為存活仔豬數,分子為腹瀉仔豬數;括號內為存活仔豬平均糞便指數。
Note: the numerator/denominator means No. of diarrhea piglets/No. of survival piglets; Numbers within parentheses indicate the mean fecal scoring.
3討論
豬流行性腹瀉病毒感染呈地方流行性,傳播較慢但感染后在養豬場持續存在,仔豬母源抗體消失后即發病,死亡率較高,同時排毒和散毒感染陸續出生的仔豬,抗生素治療無效。本實驗研制的卵黃抗體經口服后在腸道內與PEDV作用,可阻止病毒的吸附和感染,同時病毒排出體外后失去感染力,對該病流行也有一定的抑制作用。目前國內尚未見針對PEDV卵黃抗體研制的報道。
本試驗采用氯仿去脂和硫酸胺沉淀來提純卵黃抗體,卵黃經氯仿處理后易于去除脂類和不溶性蛋白,上清液澄清透明,再利用鹽沉淀可進一步提純和濃縮抗體,操作簡單方便,抗體純度高,缺點是處理樣品量少,氯仿造成環境污染。
血清抗體和卵黃抗體效價比較結果顯示,免疫后血清抗體效價先上升,到達峰值后下降也較快;卵黃抗體效價上升稍慢,但達到峰值后常維持較長時間,下降也較慢;但血清抗體和卵黃抗體效價總的變化趨勢是一致的。
卵黃抗體的分子量約為180kd,由兩條重鏈和兩條輕鏈組成,本實驗蛋白質電泳結果顯示兩條蛋白條帶分別為66kd的重鏈和35kd的輕鏈,說明龙8娱乐官方网站已提純制備了卵黃抗體。
通過仔豬攻毒和卵黃抗體治療試驗顯示,口服卵黃抗體的仔豬得到了有效保護,說明卵黃抗體具有明顯的抗病毒活性,可以應用于PEDV感染仔豬的治療。
豬場一旦發生PED,目前尚沒有特別有效的防治措施,因而該病應以預防為主,在加強養豬場綜合預防措施的同時,在有豬流行性腹瀉發病史的豬場,給妊娠母豬注射弱毒疫苗,新生仔豬添加卵黃抗體,對防治該病將具有重要意義。
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