1、單層細胞的裂解
a)吸出培養液,以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞,重復1次,將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上,再將鋁板置于冰盤上。
b)直徑為
c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液,用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。(蛋白酶消化緩沖液配方:0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0),25mmol/L EDTA(pH8.0),0.3mol/L NaCl,2% SDS)
d)用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。重復3-4次,剪切DNA。
e)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于
2、懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a)于
b)估計細胞沉淀的體積,用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液,用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內。重復3-4次,剪切DNA。
d)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于
二、提取步驟
1、用等體積酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白質。
2、用吊桶式轉頭于室溫以
3、于
4、每個直徑為
5、分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇(DTT),然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。
6、加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml,混勻,于
7、分別按10mmol/L和0.2%的終濃度加EDTA和SDS。
8、用等體積酚:氯仿抽提1次。
9、于室溫以
10、用微量離心機于
11、吸出所有的乙醇,將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘,讓最后殘存的痕量乙醇揮發干凈。
12、用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-
三、注意事項
1、測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液離心沉淀RNA,以400水重溶,測定OD260值,OD260=1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2、如果需要,可用oligo(dT)-纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。
3、某些情況下(例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時),必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則,當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題,反轉錄過程中法染的模板DNA片段可能會與RNA雜交而充當引物,從而導致物定mRNA5'末端定位的錯誤或產生截短的cDNA克隆。
a)步驟12后,加200μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),用自動微量移液器反復吹吸,以重懸核酸沉淀,將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。
b)用微量離心機于室溫以
c)棄上清液,用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),分混勻,加入550μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液,在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于
d)棄上清液,用300μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-
回收RNA時,只需取出1小份貯存液,加3mol乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L充分混勻,用微量離心機于
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