1、取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照加入1.5ml滅菌eppendorf管;
2、加600ul異硫氰酸胍,然后加入對照和樣品,再加200ul氯仿,顛倒混勻;
3、13000rpm離心15min;
4、在第3步離心快結束時,另取同樣多eppendorf管,加入400ul于
5、取第3步離心的上清(一定不要吸取到中間白色層,第3步離心結束往外拿的時候,管子盡量不要傾斜)轉移到第4步準備的管中,顛倒混勻;
6、13000rpm離心15min,輕輕倒去上清,在吸水紙上盡量沾干液體;
7、加600ul75%乙醇,顛倒數次以洗滌殘存異丙醇;
8、13000rpm離心15min,輕輕倒去上清,在吸水紙上盡量沾干液體;
9、4000rpm離心10sec,將管壁殘存液體甩到底部,用微量槍頭吸干,室溫干燥2-3min(不可過分干燥,防止下一步RNA不溶解);
10、加入20ulDEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水),輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec,冰上保存備用(最好2小時內使用,以免RNA降解)。
二、TRIzol LS提取法
所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行,防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶。
1、在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul,再加入TRIzol LS500ul,充分混勻,室溫放置10min;
2、加入200ul的氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩離心管(溶液充分乳化,成乳白狀,無分相現象),室溫放置10min(由于氯仿沸點低、易揮發,振蕩時離心管可能爆開,小心);
3、
4、加入等體積異丙醇,輕輕顛倒離心管充分混勻液體,室溫放置10min;
5、
6、1ml75%乙醇洗一遍,
7、加入適量DEPC處理水。(如果材料來源豐富的話,加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量;若要省著點用,則自己看著辦了,盡量不要加太多的水);
8、建議立即做RT。若要保存,可在上一步加入乙醇后凍存于-
三、Trizol法提取法(這是提禽流感病毒的步驟,供參考)
Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。
1、取雞胚尿囊液,加入5-10倍體積Trizol液,混勻;
2、室溫放置5分鐘,然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒;
3、取上層水相于一新的離心管,按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,
4、棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,混勻,
5、重復第4步;
6、小心棄去上清液,然后室溫干燥5-10分鐘,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度;
7、然后將RNA溶于水中,放置10分鐘。
[注意]
1、整個操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作;
2、加氯仿前的勻漿液可在
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