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農桿菌介導的植物遺傳轉化



錄入時間:2010-10-27 9:05:18 來源:西北農林科技大學

    (一)實驗目的
  1.全面了解農桿菌介導的植物轉基因的方法;
  2.根據已學的知識,設計一個農桿菌介導植物的遺傳轉化實驗方案;
  3.掌握農桿菌培養,植物外植體無菌系建立,農桿菌侵染和轉化體篩選等一系列試驗方法。
  (二)培養基
  1LB培養基:每升含有:酵母浸膏 5 g , 胰蛋白胨 10 g NaCl 5 g PH 7.2
  2YEB培養基:每升含有:牛肉浸膏 5 g ,酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ,蔗糖 5 g MgSO4·H2O 0.5 g PH 7.0

3YEP培養基:每升含有:牛肉浸膏 10 g ,酵母提取液 10 g NaCl 5 g PH 7.0

4.實生苗培養基: 1/2MS培養基,附加30g蔗糖和0.6%瓊脂,PH=6.0
  5.預培養基:MS+1.01.2mg/L  24-D+0.2mg/L 6-BA+30g蔗糖+6g瓊脂,PH=5.8
  6.分化培養基:MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+30g蔗糖+6.5g瓊脂+AgNO36mg/L PH=5.8
  7.篩選培養基:分化培養基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L KanPH=5.8
  (三)試驗儀器
  超級超凈工作臺
  智能氣候培養箱
  大型落地式高速冷凍離心機
  凝膠成像系統
  臺式常溫高速離心機
  立式滅菌鍋
     
電泳相關設備
  (四)農桿菌介導植物轉化實驗步驟(以油菜子葉轉化為例)
  1.根癌農桿菌的培養
  將保存于甘油中的菌種用劃線法接種于LB固體平板培養基上培養,每次轉化前一天從平板上挑取單菌落接種于YEB液體培養基中,在26℃170r/min的搖床上過夜培養,當OD600值達0.30.5時,將其在4000r/min的條件下離心5min,棄去上清,然后用液體MS培養基將其重懸稀釋58倍待用。

2.建立無菌苗
  將油菜種子用75%酒精浸泡30s后,于0.1%HgCl2溶液中處理10min,無菌水沖洗3次后,接種于1/2MS固體培養基上,在25±1℃黑暗條件下培養3d,后移至光下培養13d,取其下胚軸和帶柄子葉接種在預培養基上,在25℃,光照強度為2000lux16h光照周期培養條件下培養,待用。
  3.農桿菌侵染
  在無菌條件下,將預培養2d子葉和下胚軸收集于一個無菌小燒杯中,浸入于活化并稀釋了58倍的農桿菌液中,5min后轉到無菌濾紙上,吸干多余的菌液,接至共培養培養基中,在25℃生化培養箱中共培養2 d
  4.分化培養 
  將共培養2d的受體材料先用無菌水沖洗23次至水澄清后,用500mg/LCef浸泡3040min,材料取出并置于含有無菌濾紙的培養皿中干燥2d。將培養物轉移至附加815mg/L卡那霉素和500mg羧芐青霉素(或頭孢霉素)的分化培養基中,在25℃,晝夜光周期為168h恒定光照條件下培養,
  5.篩選培養
  將分化培養中獲得的綠芽移置篩選培養基(卡那霉素濃度升致25mg/L),每隔1520d轉接一次。
 

 

 

 

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