超聲破碎的條件一般是300w,10s/10s,20分鐘,具體條件可根據自身情況而定。
超聲前菌體的準備:菌液離心后,先用PBS將菌沉淀洗2-3遍,然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體,裂解液的成分:50mMTris-HCl, pH8.0,
如何判斷是否超聲完全:根據網友的經驗,一般有以下幾個方面:
1, 外觀判斷:超聲前菌懸液是渾濁的,超聲完全后變的透明、清澈。
2, 液體的粘滯性:超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。
3,高速離心:有用高速離心檢測超聲破碎程度的(一般用
4,染色:破碎后的菌液涂片,革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鐘,鏡檢。
超聲后加入核酸酶消除核酸對蛋白的污染。
一些需要注意的問題:
1??,蛋白以包涵體形式表達,追求的是高破碎率,要求細胞碎片很小,而另一種蛋白是可溶形式表達,所以細胞碎片不能很小,兩種情況要求不同但目的相同,都是便于后期的固液分離。
2,如果超聲時出現黑色沉淀,說明超聲功率太強。
3,超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。
4,盡量防止泡沫的產生。
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