瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細菌生長??情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結果可靠，易發現污染菌；缺點是制備含藥瓊脂平板費時費力。
1.培養基制備
使用MH瓊脂，按商品說明書進行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺藥時，使用溶解的馬血）。
2.含藥瓊脂平板制備
根據實驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制藥物瓊脂平板，根據需要來選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可貯存5天。
3.接種物制備與接種
制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，以多點接種器吸取制備好菌液（約1~2μl）接種于瓊脂平板表面，每點菌數約為10⁴CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌孵育時間應滿24h），觀察結果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環境中孵育。
4.結果判斷
將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細菌生長的最低藥物濃度作為終點濃度。
如果出現有2個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現象，則應檢查培養物純度或重復?試驗。

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