一 實驗目的

  1、掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。

   2、觀察雙歧桿菌的形態特征并了解雙歧桿菌的生長特性。

   3、了解雙歧桿菌鑒定的一般方法。

二 基本原理

    ??厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。雙歧桿菌是專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，雙歧桿菌的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。

    雙歧桿菌的最適生長溫度37℃~41℃，最低生長溫度25℃~28℃，最高43℃~45℃。初始最適pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5?不生長。其細胞呈現多樣形態，有短桿較規則形、纖細桿狀具有尖細末端形、球形、長桿彎曲形、分枝或分叉形、棍棒狀或匙形。單個或鏈狀、V??形、柵欄狀排列，或聚集成星狀。革蘭氏陽性，不抗酸，不形成芽孢，不運動。雙歧桿菌的菌落光滑、凸圓、邊緣完整、乳脂至白色、閃光并具有柔軟的質地。雙歧桿菌是人體內的正常生理性細菌，定殖于腸道內，是腸道的優勢菌群，占嬰兒消化道菌叢的92%?。該菌與人體終生相伴，其數量的多少與人體健康密切相關，是目前公認的一類對機體健康有促進作用的代表性有益菌。該菌可以在腸粘膜表面形成一個生理性屏障，從而抵御傷寒沙門氏菌、致瀉性大腸桿菌，痢疾致賀氏菌等病原菌的侵襲，保持機體腸道內正常的微生態平衡；能激活巨噬細胞的活性，增強機體細胞的免疫力；能合成B??族維生素、煙酸和葉酸等多種維生素；能控制內毒素血癥和防治便秘，預防貧血和佝僂病；可降低亞硝胺等致癌物前體的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羥自由基及脂質過氧化，具有抗衰老功能。

    ?雙歧桿菌的培養方法很多，如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施，操作步驟多，較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術 ??。以后這項技術又經歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善，并逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術，而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優點是：預還原培養基制好后，可隨時取用進行試驗；任何時間觀察或檢查試管內的菌都不會干擾厭氧條件。

目前，雙歧桿菌鑒定的方法有很多種。近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學技術對雙歧桿菌進行基因指紋圖譜的構建，分析不同雙歧桿菌種間存在的同源性和多態性；RAPD??技術也可用于雙歧桿菌菌種鑒定及分型。一般來講，龙8娱乐官方网站都應用適合鑒定所有厭氧菌的方法，主要包括雙歧桿菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發酵試驗和其他相關指標等。

三 實驗用具

    高純氮氣   厭氧管  注射器  培養箱   冰塊  水浴鍋   鑷子  記號筆  MRS培養基   細菌生化微量鑒定管  酒精棉球  瓷盤   振蕩器  銅柱除氧系統  定量加樣器  恒溫水浴  載玻片  顯微鏡  恒溫培養箱  超聲波破碎儀  濾紙  層析缸  酒精燈  封口膜  厭氧罐  等。

四、實驗方法與步驟

    1 銅柱系統除氧

    銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40～400mm??，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N₂、CO₂ 和H₂等都含有微量O₂，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O₂化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變為黑色。當向氧化狀的銅柱通入H₂時，H₂與CuO中的氧就結合形成H₂O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現明亮的黃色。此銅柱可以反復的使用，并不斷起到除氧的目的。當然H₂源也可以由氫氣發生器產生。

    2 預還原培養基及稀釋液的制備

    ??制作預還原培養基及稀釋液時，先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養基裝4.5～5.0mL，稀釋液裝9mL，并插入通N₂氣的長針頭以排除O₂。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最后變成無色，說明試管內已成為無氧狀態，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。

    3 分離

    （1）編號

    取五支無菌水試管，分別用記號筆標明10^-1、10^-2……10^-5。

    （2）稀釋

    在無菌條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10^-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10^-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10^-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10^-7，制成不同樣品稀釋液。通常選10^-5、10^-6、10^-7三個稀釋度進行滾管計數。

    （3）滾管分離

      a、滾管

    將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，用無菌注射器吸取10^-4、10^-5、10^-6三個稀釋度各0 .1mL?，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。

      b、分離

    ??生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養。培養24h或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。

    4 計數并鏡檢

    （1）計數

    ??液體純培養物經系列稀釋后，按上述滾管法培養。然后對固體滾管計數，計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數量。公式如下：

雙歧桿菌數量cfu/g（mL）樣品=0.1mL滾管計數的實際平均值×10×稀釋倍數

    （2）鏡檢

     挑取特征性菌落制片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察菌體形態。

    5 菌種鑒定

    ⑴ 雙歧桿菌特定酶的檢測

    利用果糖-6-磷酸鹽對分離得到的菌種進行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）的測定，初步確定菌種是否為雙歧桿菌屬。F6PPK測定的操作如下：

    ① 將從樣品中分離出的雙歧桿菌培養于厭氧液體改良MRS培養基中37℃生長24 h。

    ② 將菌液4400 rpm離心10 min,收集菌體，緩沖液ⅰ洗滌2次，最后溶于約4 mL緩沖液ⅰ中，制成細菌懸液。

    緩沖液

    ⅰ 現用現配。取0.05 M Na₂HPO4 31.5 mL和0.05 M NaH₂PO₄ 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-鹽酸鹽。

    ③ 用超聲波粉碎儀，400 W條件下；每處理5 s、間隔5 s,超聲粉碎8 min，至菌體溶液呈半透明。

    ④ 破碎后，取0.5 mL 于離心管中，加試劑ⅱ和ⅲ各125 µL,37℃保溫30 min。

    ⅱ 6 mg/mL氟化鈉加10 mg/mL 碘乙酸鈉。

    ⅲ 果糖-6-磷酸鹽80 mg/mL水溶液。

    ⑤ 加試劑ⅳ 0.750mL, 室溫10 min。

    ⅳ 現用現配。鹽酸羥胺139 mg/mL。酸性極強，用氫氧化鈉中和至pH6.5。

    ⑥ 加試劑ⅴ和ⅵ各500 µL, 室溫5 min。

   ⅴ 三氯乙酸（TCA）水溶液15 g/100 mL。

   ⅵ 4 M HCl。

    ⑦ 加試劑ⅶ 500 µL, 顯色。紅褐色或紅紫色為陽性，黃色為陰性。

    ⅶ 0.5 g/100 mL FeCl₃·6H₂O溶于0.1 M HCl。

    ⑵ 乙酸、乳酸等有機酸的測定——紙層析法

    ① 層析濾紙的制備——將層析濾紙剪成1.5cm*11cm的長條狀，在距層析紙一端約4cm處用鉛筆劃線確定點陽線，使用前充分干燥。

    ② 配制展開劑——正丁醇:甲酸:水=80:15:5

    ③ 配制標準液——配制1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液

    ④ 制備待測樣品——將菌種37℃ 培養24h后離心，收集上清液

    ⑤ 點樣——用毛細管分別吸取發酵液，多次點樣于濾紙條上，樣點直徑不宜超過2mm，平衡2h

    ⑥ 層析——??將點好樣的層析紙放入，使點有樣品的一端浸在展開劑中，但不可浸及樣點。觀察展開情況，待展開劑前沿到達離層析紙另一端約1.5cm處，取出層析紙。

    ⑦ 顯色——以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發之后，向層析濾紙噴灑并計算Rf值。

注釋：物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用R_f值 (比移值 R_f value 又稱R_f值) 來表示：

    R_f = 原點到層析中心的距離 / 原點到溶劑前沿的距離

    在一定的條件下某種物質的R_f值是常數。R_f?值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關，是一個定性分析的重要參數。

    ⑶糖發酵試驗

    ??糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8（紫色）]，當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。

本實采用現成的細菌生化微量鑒定管 ，鑒定管的種類如下：

    乳糖    麥芽糖      甘露糖   甘露醇    蔗糖    阿拉伯糖 D-核糖   木糖（木膠糖）  半乳糖   松三糖  山梨糖    淀粉   水楊素    葡萄糖酸鹽       草糖（海藻糖）  血清菊糖   棉子糖    果糖   蜜二糖   纖維二糖

    具體實驗步驟：

    ① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。

    ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。

    ③ 24h??后觀察各管中液體變顏色情況，若變色則為陽性，反之陰性，對照凌代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》“鑒別雙歧桿菌屬內種的特征”表即可初步確定其種別。

五 注意事項

    1 注射器在使用前必須經過121℃、20min滅菌。

    2 注意無菌操作，保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。

    3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基后，如需再次吸取，應快速將注射器插入厭氧管中，以防止針頭污染。

六 實驗結果記錄

（下列表格供參考）

表一  雙歧桿菌培養過程中菌落計數

表二  雙歧桿菌菌株屬的鑒定指標與鑒定結果

表三 雙歧桿菌菌株糖醇發酵試驗結果

     　?          注：表中+表示待測菌株陽性，-表示待測菌株陰性

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