龙8娱乐官方网站微信公眾號
龙8娱乐官方网站天貓旗艦店
龙8娱乐官方网站微信公眾號
龙8娱乐官方网站天貓旗艦店
|
1、外植體的選擇
外植體是指植物組織培養中的各種接種材料。從理論上講，植物細胞都具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個細胞和原生質體都可以作為外植體。但實際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養的難易程度不同。為保證植物組織培養獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。
（1）選擇優良的種質及母株
無論是離體培養繁殖種苗，還是進行生物技術研究，培養材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優良的種質、特殊的基因型和生長健壯的無病蟲害植株。尤其是進行離體快繁，只有選取優良的種質和基因型，離體快繁出來的種苗才有意義，才能轉化成商品；生長健壯無病蟲害的植株及器官或組織代謝旺盛，再生能力強，培養后容易成功。
（2）選擇適當的時期
組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節和生長發育階段，對大多數植物而言，應在其開始生長或生長旺季采樣，此時材料內源激素含量高，容易分化，不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。若在生長末期或已進入休眠期時采樣，則外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應。花藥培養應在花粉發育到單核靠邊期取材，這時比較容易形成愈傷組織。百合在春夏季采集的鱗莖、片，在不加生長素的培養基中，可自由地生長、分化；而其他季節則不能。葉子花的腋芽培養，如果在1月至翌年2月間采集，則腋芽萌發非常遲緩；而在3-8月間采集，萌發的數目多，萌發速度快。
（3）選取適宜的大小
培養材料的大小根據植物種類、器官和目的來確定。通常情況下，快速繁殖時葉片、花瓣等面積為5mm2，其他培養材料的大小為0.5~1.0cm。如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。材料太大，不易徹底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難以成活。
（4）外植體來源要豐富
為了建立一個高效而穩定的植物組織離體培養體系，往往需要反復實驗，并要求實驗結果具有可重復性。因此，就需要外植體材料豐富并容易獲得。
（5）外植體要易于消毒
在選擇外植體時，應盡量選擇帶雜菌少的器官或組織，降低初代培養時的污染率。一般地上組織比地下組織消毒容易，一年生組織比多年生組織消毒容易，幼嫩組織比老齡和受傷組織消毒容易。
2、外植體取材的部位
植物組織培養的材料幾乎包括了植物體的各個部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。
（1）莖尖
莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發生變異，而且莖尖培養是獲得脫毒苗木的有效途徑。因此莖尖是植物組織培養中最常用的外植體。
（2）節間部
大部分果樹和花卉等植物，新梢的節間部是組織培養的較好材料。新梢節間部位不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，因此是常用組織培養材料。
（3）葉和葉柄
葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養中常用的材料。尤其是近年在植物的遺傳轉化中，以葉片為試驗材料的報道很多。
（4）鱗片
水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。
（5）其他
種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養的材料。
但是，不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的。如百合科植物風信子、虎眼萬年青等比較容易形成再生小植株，而郁金香就比較困難。百合鱗莖的鱗片外層比內層的再生能力強，下段比中、上段再生能力強。選取材料時要對所培養植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選出合適的、最易表達全能性的部位作為為植體。
3、外植體的消毒
植物組織培養用的外植體大部分取自田間，表面上附著大量的微生物，這是組織培養的一大障礙。因此在材料接種培養前必須要消毒處理，消毒一方面要求把材料表面上的各種微生物殺滅，同時又不能損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長。因此，外植體的消毒處理是植物組織培養工作中的重要一環。
（1）常用的消毒劑
常用的消毒劑如下表所示。理想的消毒劑應具有消毒效果好，易被無菌水沖洗掉或能自行分解，對材料損傷小，對人體及其他生物無害，來源廣泛，價格低廉。
常用消毒劑的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒劑，以70%~75%酒精殺菌效果最好，95%或無水酒精會使菌體表面蛋白質快速脫水凝固，形成一層干燥膜，阻止了酒精的繼續滲入，殺菌效果大大降低。
酒精具有較強的穿透力，使菌體蛋白質變性，殺菌效果好。同時它還具有較強的濕潤作用，可排除材料上的空氣，利于其他消毒劑的滲入。但酒精對植物材料的殺傷作用也很大，浸泡時間過長，植物材料的生長將會受到影響，甚至被酒精殺死，使用時應嚴格控制時間。但酒精不能徹底消毒，一般不單獨使用，多與其他消毒劑配合使用。
②升汞
又稱氯化汞，Hg2+可以與帶負電荷的蛋白質結合，使蛋白質變性，從而殺死菌體。升汞的消毒效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無菌水反復多次沖洗。升汞對環境危害大，對人畜的毒性極強，使用后應做好回收工作。
③次氯酸鈉
次氯酸鈉是一種較好的消毒劑，它可以釋放出活性氯離子，從而殺死菌體。其消毒能力很強，不易殘留，對環境無害。但次氯酸鈉溶液堿性很強，對植物材料也有一定的破壞作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸鈣[Ca(ClO)2]，消毒效果很好，對環境無害。它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤過氧化氫
也稱雙氧水，消毒效果好，易清除，又不會損傷外植體，常用于葉片的消毒。
⑥新潔爾滅
這是一種廣普表面活性消毒劑，對絕大多數植物外植體傷害很小，殺菌效果好。
（2）消毒方法
①莖尖、莖段及葉片等的消毒
消毒前先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，然后用自來水沖洗。對于一些表面不光滑或長有絨毛的材料，可用洗滌劑清洗，必要時用毛刷充分刷洗，硬質材料可用刀刮。
消毒時在超凈臺上操作，先用70%酒精浸泡10~30s，以無菌水沖洗2~3次，然后按材料的老、嫩和枝條的堅實程度，分別采用2%次氯酸鈉浸泡10~15min或用0.1%升汞浸5~10min。消毒時要不斷攪動，使植物材料與消毒劑充分地接觸。若材料有絨毛，最好在消毒液中加入幾滴Tween-20，最后用無菌水沖洗3~5次。
②果實及種子的消毒
先用自來水沖洗10~20min，再用酒精迅速漂洗一下。果實用2%次氯酸鈉浸10min，后用無菌水沖洗2~3次。種子則先用10%次氯酸鈉浸泡20~30min，難以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。對于種皮太硬的種子，也可預先去掉種皮，再用4%次氯酸鈉浸泡8~10min。
③花藥的消毒
用于組織培養的花藥多未成熟，其外面有花萼、花瓣或穎片保護，處于無菌狀態。消毒時將整個花蕾或幼穗用70%酒精浸泡數秒鐘，然后用無菌水沖洗2~3次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用無菌水沖洗2~3次。
④根及底下部器官的消毒
由于這類材料生長于土壤中，表面帶菌量大，消毒較為困難。可先用自來水沖洗，軟毛刷刷洗，用刀切去損傷及污染嚴重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1%升汞中浸5~10min或2%次氯酸鈉中浸10~15min，最后用無菌水沖洗3次。
在操作時要根據材料的大小、幼嫩、質地等差異做出判斷后，再選擇適宜的消毒劑種類、濃度和消毒時間，切不可生搬硬套。消毒的最佳效果應以最大限度地殺死材料上的微生物，而又對材料的損傷最小為好。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
上一篇：植物組培培養基的滅菌
下一篇：外植體的接種
