獼猴桃細菌性潰瘍病菌的分離鑒定方法
1、病原鑒定
根據葉片上的水漬狀暈圈和枝干上白色水滴狀菌膿初步診斷為細菌性病害。取病健交界處組織一塊,放于載玻片上,向小塊上滴1–2滴無菌水或蒸餾水,加蓋玻片后。立即用低倍顯微鏡觀察水滴與組織交界處,見到云霧狀菌溢,亦可證明組織內有細菌存在。
2、病原分離
新鮮病健交界處的病組織洗凈后切成
培養皿稀釋分離法:取滅菌后的培養皿3–4個,每皿加滅菌水
平板劃線培養法:將上述的病組織放在滅菌載玻片上的一滴滅菌水中,玻棒攪碎,靜置一段時間,用滅菌的接種環在普通培養基或選擇性培養基上劃線培養。
培養基可選用:
肉汁胨瓊脂培養基(BPA):
牛肉浸膏??
蛋白胨? 5–
蔗糖??
酵母膏?
瓊脂??
蒸餾水?? 1000 ml
pH? 7.0
培養性狀:菌落圓形,污白色,全緣,微凹,光滑,生長緩慢,直徑約1–
蔗糖蛋白胨培養基(SPA):
蔗糖 ?
蛋白胨??
K2HPO4??
MgSO4•7H2O
瓊脂?
蒸餾水?? 1000 ml
pH? 7.2–7.4
培養性狀:菌落呈粘稠狀。
金氏B培養基(KBA):
甘油 ??
膘蛋白胨(proteose peptone)
K2HPO4??
MgSO4•7H2O
瓊脂(水洗)?
蒸餾水?? 1000 ml
pH? 7.2
培養性狀:有黃綠色熒光。
3、致病性測定
應選擇未成熟的及正在迅速生長的植物的新梢、新葉進行;盡可能模擬自然侵染方式接種寄主。
將培養24–72 h的單胞菌落制成菌懸液,濃度為3×108 CFU/ml,進一步稀釋到104–107 CFU/ml,用針刺法或涂抺傷口法對獼猴桃離體枝葉或幼苗、新枝等進行接種,溫度為
如分離所得菌株過多,可采取煙草過敏反應(HR)以快速測定分離物的致病性。方法是配制107–108 CFU/ml的菌懸液,用注射針將菌液從煙草下表皮注入葉肉組織間。煙草植株應保持在
HR測定是LOPAT試驗的測定項目之一,對于熒光假單胞菌的鑒定很有意義。獼猴桃細菌性潰瘍病的HR為陽性。
4、形態特征觀察
細菌的形態和大小的觀察:用接種環從固體培養基表面挑取少量細菌和蒸餾水混合,配成細菌懸浮液,取一滴懸浮液均勻地涂于干凈的載玻片上,任其自然干燥,通過火焰2–3次固定后染色,所用菌種齡應在24–48 h,可用苯酚品紅染色法染色。
革蘭氏染色的菌體通常也可同時進行細菌菌體形態、大小及排列情況的觀察。
革蘭氏染色法:獼猴桃細菌性潰瘍病菌為革蘭氏陰性。可用結晶紫草酸銨染色法進行。另外,用KOH溶解試驗可作為輔助試驗,快速確定細菌的革蘭氏屬性。方法如下:取1–2滴3 % KOH溶液置于干凈載玻片上,用接種環或牙簽將培養24–48 h的單個或少許幾個菌落移到KOH液滴中,攪動5–15 s后,用接種環或牙簽將菌液向上提取,觀察提取時有無粘絲現象出現。凡是革蘭氏陰性菌提取時都有清楚的粘絲相連,且KOH液滴變稠。
鞭毛染色觀察:可用西薩–基爾染色方法。
獼猴桃細菌性潰瘍病菌為極生單鞭毛,少有2–3根。
莢膜染色法:獼猴桃細菌性潰瘍病菌無莢膜。
芽孢染色法:獼猴桃細菌性潰瘍病菌無芽孢。
經過以上癥狀觀察、病原菌分離、培養性觀察、致病性測定及形態特征觀察、即可基本完成病原菌的鑒定。
獼猴桃細菌性潰瘍病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae的主要特征
菌體短桿狀,大小為(1.4–2.3)μm×(0.4–0.5)μm,革蘭氏染色陰性,無莢膜,不產芽孢;鞭毛單極生1–3根。
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