實驗目的:學習并掌握分離純化微生物的基本技能和篩選高效脫酚菌的實驗方法
實驗材料:
1.培養基
(1) 營養肉湯液體培養基。
(2) 營養肉湯瓊脂培養基。
(3) 脫酚菌分離培養基:蛋白胨
(4) 苯酚標準溶液:稱取分析純苯酚
(5) 四硼酸鈉飽和溶液:稱取Na2B4O7
(6) 3% 4-氨基安替比林溶液:稱取分析純4-氨基安替比林
(7) 2%過硫酸胺溶液:取化學純過硫酸胺
2.儀器 恒溫振蕩器、恒溫培養箱、離心機、分光光度計。
3.其它 玻璃珠、錐形瓶、培養皿等
實驗原理:
環境中存在著各種各樣的微生物,其??中某些微生物以有機污染物作為其生長所需的能源、碳源或氮源,從而使有機污染物得以降解。在工業廢水的生物處理中,對污染成分單??一的有毒廢水常可選育特定的高效菌種進行處理。這些高效菌具有處理效率高、耐受毒性強等優點。本實驗在以苯酚為唯一碳源的培養基中,經富集培養、分離純化、降解試驗等,可篩選出高效脫酚菌。
其中酚濃度的測定采用4-氨基安替比林法。其基本原理:4-氨基安替比林和酚類化合物在堿性溶液中和氧化劑鐵氰化鉀作用,生成紅色的安替比林染料,與標準管比色,可測出水??樣中酚的含量。生成的色度在水中能穩定約30min,可在波長510nm處比色測定。本法最低檢出濃度為0.1mg/L。
實驗內容:
1.采樣 為了獲得酚分解能力較強的菌種,可在高濃度含酚廢水流經的場所采樣。如排放含酚廢水下水道的??淤??泥.沉渣等,在這些地方分得的微生物往往降解酚能力較強。
2.富集培養 將樣品置于裝有玻璃珠的50mL液體培養基并加有適量苯酚的三角瓶中,
3.平板的分離和純化
(1)用無菌移液管吸取經富集培養的混合菌液0.lmL,注入9.9mL無菌水中,充分混勻,并繼續稀釋到適當濃度。
(2)取最后三個稀釋管,分別自各管中吸取稀釋菌液,滴一滴(約0.05mL)于固體平板(倒平板時添加適量的酚,最終酚濃度為50mg/L左右)中央,每個稀釋度做2~3個重復。
(3)用無菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平,蓋好皿蓋。室溫放置,待接種菌液被培養基吸收后,倒置于
(4)挑選不同形態的菌落,在含適量酚的固體平板上劃線純化。平板倒置于
4.轉接斜面 將純化后的單菌落轉接至補加適量酚的試管斜面,
5.降解試驗 用接種環取各斜面菌苔一環,分別接種于100mL營養肉湯液體培養基中,振蕩培養至對數生長期(
6.測定含酚量
(1) 取經降解的培養液,10000r/min離心10min后,取上清100μL加入到10mL的試管中,加蒸餾水到5mL,加100uL0.5mol/L的氨水,50uL的2%的4-氨基安替比啉,混均,再加入50uL的8%的鐵氰化鉀溶液,混均,15min后,在510nm處測吸光度。
(2) 計算酚含量,井算出酚的去除率。
酚/(mg·L-1)=從標準曲線上查得的酚(mg)×1000/V
式中V:取測定樣體積。
細菌脫酚率/%=(培養前酚濃度-培養后酚濃度)/培養前酚濃度*100%-酚揮發率(%)
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