一、 方法概要
本方法系以0.45 μm孔徑之濾膜過濾水樣，檢測水中大腸桿菌(Escherichia coli)。水樣過濾后置于mTEC培養基(modified membrane-Thermotolerant Escherichia coli Agar，縮寫為modified mTEC Agar)上，于35±1℃培養2小時，再以44.5±0.5℃培養22~24小時，大腸桿菌會形成紅色或紫紅色菌落。
方法原理是培養基內含之色原(5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸，5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)被大腸桿菌之尿甘酸化酶(β-D-glucuronidase)催化而產生紅色或紫紅色菌落。
二、 適用范圍
本方法適用于飲用水水質、飲用水水源水質、地面水體、地下水體、廢水、污水、及海水等水樣中大腸桿菌之檢驗。但不適于高濁度及含有干擾物質水樣之檢測。
三、 干擾
（一） 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質時，會影響水樣之檢測結果。
（二） 檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質時，會影響水樣之檢測結果。
（三） 懸浮微粒過高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落彌漫生長(Spreading)而影響水樣檢驗結果之判讀。
四、 設備
（一） 量筒：一般使用100~1000 mL之量筒。
（二） 吸管：一般使用1~10 mL之滅菌玻璃吸管或無菌塑料吸管，應有0.1 mL之刻度。
（三） 稀釋瓶： 100~1000 mL能耐高壓滅菌之有蓋硼硅玻璃制品。
（四） 三角錐瓶：250~2000 mL能耐高壓滅菌之硼硅玻璃制品。
（五） 采樣容器：無菌之玻璃或塑料制有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。
（六） 培養皿：硼硅玻璃或可拋棄式塑料制培養皿。可使用60×15 mm、50×12 mm或其它適當大小者。
（七） 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑料、陶瓷或不銹鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定于底座。
（八） 抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。
（九） 濾膜：使用直徑47 mm、孔徑0.45 µm且有格子記號的無菌濾膜，能使水中大腸桿菌完全滯留者。
（十） 鑷子：前端圓滑內側無波紋。
（十一）水浴槽：溫度能維持在50℃左右者。如用于44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。
（十二）培養箱：溫度能維持在35±1℃者。如用于44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。
（十三） 加熱板：附磁石攪拌功能者。
（十四） 天平：能精稱至0.01 g者。
（十五） 高壓滅菌釜：能以中心溫度121℃（壓力約15 lb/in2或1.1 kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。
（十六） 烘箱:用于玻璃器皿等用具之干熱滅菌，溫度能維持在160℃達2小時或170℃達1小時以上者。
五、 試劑及材料
本方法所使用的化學藥品均為試藥級，培養基為微生物級制品。
（一） 培養基
mTEC培養基(modified mTEC Agar）成份：
3號蛋白胨(Protease Peptone ＃3) 5.0 g
酵母抽出物(Yeast Extract) 3.0 g
乳糖(Lactose) 10.0 g
氯化鈉(Sodium Chloride) 7.5 g
磷酸氫二鉀(Dipotassium Phosphate) 3.3 g
磷酸二氫鉀(Monopotassium Phosphate) 1.0 g
硫酸月桂酸鈉(Sodium Lauryl Sulfate) 0.2 g
脫氧膽酸鈉(Sodium Desoxycholate) 0.1 g
5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸(5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) 0.5 g
瓊脂(Agar) 15.0 g
使用市售商品化培養基45.6 g，加入1公升的蒸餾水，煮沸溶解后以121℃高溫高壓滅菌15分鐘，培養基最終pH值應為7.3±0.2。取出后置于45~50℃之水浴槽待溫度下降至恒溫，培養基混搖均勻后分裝于培養皿中，厚度約3~5 mm。凝固后避光保存于冰箱中備用，分裝后之培養基保存期限為14天。可依檢測需要量按比例適量配制。
（二） 無菌稀釋液
無菌稀釋液一：非海水水樣檢測稀釋用。配制方法如下：
磷酸二氫鉀儲備溶液
取3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于50 mL的蒸餾水中，待完全溶解后，以1.0 M NaOH溶液調整其pH值為7.20±0.05，然后加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)后，儲存于冰箱中作為儲存液備用。
氯化鎂儲備溶液
取8.1 g氯化鎂（MgCl2‧6H2O）先溶于少量蒸餾水，待完全溶解后，再加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)后，保存于冰箱中作為儲存液備用。
無菌稀釋液
分別取10 mL氯化鎂儲備溶液和2.5 mL磷酸二氫鉀溶液，加入蒸餾水至全量為2000 mL，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經121℃高溫高壓滅菌15分鐘，作為無菌稀釋液備用。
無菌稀釋液二：海水或含鹽水樣稀釋用。
磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 0.58 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.50 g
氯化鈉(NaCl) 8.50 g
將上述成分溶解于1公升的蒸餾水中，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經121℃滅菌15分鐘，其滅菌后之pH值為7.4 ±0.2。
六、 采樣與保存
（一） 采取微生物檢測之水樣時，應使用清潔并經滅菌之玻璃或塑料容器或市售無菌采樣袋。且于采樣時應避免受到污染。水樣若含有余氯時，無菌容器中應加入適量無菌之硫代硫酸鈉（120 mL的水樣中加入0.1 mL、10﹪的硫代硫酸鈉可還原15 mg/L的余氯）。
（二） 水樣運送及保存之溫度應維持在0~5℃并于采樣24小時內完成檢測。
（三） 水樣量以能做完所需檢測為度，但不得少于200 mL。
七、 步驟
（一） 水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃25次以上，以使樣品充分混合均勻。
（二） 水樣稀釋：
飲用水水樣不需稀釋。
其它樣品則視水樣中大腸桿菌可能濃度范圍進行水樣稀釋。
使用無菌吸管吸取10 mL之水樣至90 mL之無菌稀釋液中，形成10倍稀釋度之水樣，混搖均勻。而后自10倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列之100、1000倍等稀釋水樣，并混搖均勻。進行上述稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。
（三） 以無菌鑷子夾起無菌濾膜，放在無菌過濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定。將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀釋液，以測定過濾設備是否裝置妥當。
（四） 檢驗飲用水水樣時，直接過濾100 mL的水樣。其它水樣視大腸桿菌可能濃度范圍，以無菌吸管吸取10 mL的原液及（或）各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾后，再以20至30 mL之無菌稀釋液沖洗漏斗。每個稀釋度水樣均需進行兩重復。
（五） 沖洗過濾后，解開真空裝置，將漏斗移開，盡速以無菌鑷子取出過濾后之濾膜置于培養基上。濾膜應與培基完全貼合，避免產生氣泡。培養皿倒置于35±1℃的恒溫培養箱中培養2小時，然后再于44.5±0.5℃的培養箱或水浴槽中培養22~24小時。如放置于水浴槽中培養，應將培養皿倒置密封于防滲水塑料袋內(如采樣袋)，塑料袋須完全浸入水中。如使用松蓋培養皿放置于培養箱中培養，應將培養皿放置于密閉容器中，且容器內側底部應放置濕紙巾或濕布，以避免培養基之水份喪失而影響細菌生長。
（六） 過濾不同稀釋度水樣時，應更換無菌過濾器（漏斗）。亦可將過濾器（漏斗）以火烤后約降至室溫重復使用。
（七） 計算并記錄各稀釋度培養皿中所產生的紅色或紫紅色菌落。若菌落過多造成判讀困難，則以「大腸桿菌菌落太多無法計數」（E. coli Too numerous to count ; TNTC）表示。
八、 結果處理
（一） 選取大腸桿菌菌落數介于20至80間之同一稀釋度的兩個培養皿，計算其每100 mL水樣之大腸桿菌菌落數，單位為CFU/100mL。計算公式如下：
大腸桿菌菌落數=所選取培養皿之紅色或紫紅色菌落數×100(CFU/100mL) 所選取培養皿之實際水樣體積總合
（二） 培養皿之大腸桿菌菌落數不在20至80個菌落之間時，則以下列方式處理：
若原液及各稀釋度水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數在20至80 個之間，則選取該稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算之。
若僅原液有大腸桿菌菌落產生，且少于20個，應循上述公式計數菌落數；若過濾100 mL原液，培養皿中均無菌落生長，則結果以「<1 CFU/100mL」表示；若過濾10 mL原液，培養皿中均無菌落生長，則結果以「<10 CFU/100mL」表示。
若各培養皿之大腸桿菌菌落數均不在20至80個之間，則選取大腸桿菌菌落數最接近80之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算。但不可選用菌落總數大于200之培養皿。
（三） 數據表示：菌落數小于100時，以整數表示（小數字四舍五入），菌落數大于100 以上時，取兩位有效數字，并以科學記號表示，例如菌落數為112時以1.1×102 表示之，菌落數為117時以1.2×102 表示之，菌落數為65000時以6.5×104 表示。
（四） 檢測紀錄必須注明采樣時間、開始培養時間、結束培養時間、培養基名稱及各稀釋度的原始數據。
九、 質量管理
（一） 微生物采樣及檢測人員應具備微生物基本訓練及知識。
（二） 進行微生物檢測時，所用的盛裝器具均應經滅菌處理。
（三） 每次采樣時，應進行一組運送空白及野外空白。
（四） 每批次或每10個水樣須進行一次試劑空白。
（五） 新購之mTEC培養基，每批次均須以已知的大腸桿菌及非大腸桿菌(例如Bacillus subtilis)之菌株作測試，以確保數據質量。
（六） 若連續一個月水樣均未檢出大腸桿菌，則須以大腸桿菌菌株進行培養基測試，以確保數據質量。
（七） 應記錄所有稀釋度水樣的原始數據，以備查核之用。
（八） 每個稀釋度水樣至少須進行二重復。
（九） 本方法培養所得之細菌可能具有感染性，檢測后之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處理。
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