一、目的與要求

（一）學習制備培養基的基本技術。

（二）制備牛肉膏蛋白瓊脂培養基。

二、原理

牛肉膏蛋白培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌培養基，這種培養基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養物質，可供作繁殖之用，制作固體培養基時須加2%瓊脂，培養細菌時，應用稀酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料與儀器

（一）試劑  牛肉膏，蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

(二)其他  試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺稱。

四、操作步驟

（一）稱量  根據用量按比例依次稱取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。

（二）溶解  在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，ZHU一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。

（三）調PH  用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH調至所需范圍。

（四）過濾  趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗結果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。

（五）分裝   按實驗要求，可將配制的培養基分裝入試管內或三解瓶內，分裝裝置如實驗圖8所示；分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液體分裝   分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。

2．固體分裝   分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超過管長的1/2。分裝三解瓶，以不超過容積的1/2為宜。

3．半固體分裝   裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。

（六）加棉塞  分裝完畢后，在試管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等，以阻止外界微生物進入培養基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

（七）包扎  棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。

（八）保存   滅菌后的培養基放入37℃養箱中培養24小時，以檢驗滅菌的效果，無污染方可使用。

 

一、目的與要求

了解干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌的操作方法。

二、原理

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變性而達到滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160～170℃），時間長（1～2h）。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于水蒸汽不能溢出而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點升高，得到高于100℃的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

一般培養基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可達到徹底滅菌,滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變.

三、材料與儀器

吸管、培養皿、試管、電熱干燥箱，手提試高壓蒸汽滅鍋，牛肉膏蛋白胨培養基、蒸餾水。

四、操作步驟

（一）干熱滅菌法  適用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養基不適用。

1．將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留有一定的間隙），關好箱門。

2．接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節器，保持加熱升溫狀態，至箱內達到100℃時關閉排氣孔。

3．當溫度升到160～170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。

4．切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未降至70度以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降導致玻璃器皿炸裂）。

（二）高壓蒸汽滅菌

1．首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角架相平為宜。

2．放回內層鍋，并裝入待滅菌物品（內裝培養基或小的三角瓶），不要裝得太擠，以免妨礙汽流通影響滅菌效果，三角瓶口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋溫包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個棉栓，使螺栓松緊一致，，勿使漏氣。

3．用電爐或其他方法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣，待冷空氣排盡后，關上排氣閥讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內達到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。

4．停止加熱，待壓力表的壓力降至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。

注意：當壓力不為零時，不能開蓋取物否則由于壓力突然下降，容器內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發生污染，甚至灼傷操作者。

5．高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構，不得隨意調節。