噬菌體廣泛分布于自然界中,凡有細菌存在的地方,就有可能有其相應的噬菌體出現,那末就可能從海水、淡水和污水中,甚至是海泥或海產品中分離到噬菌體.
1 .水中噬菌體的分離
常用的方法有濾菌器過濾法和加熱法兩種。
(1)過濾法:
取水樣300 毫升.加到100 毫升四倍濃度肉湯蛋白胨培養基內,再加入要分離的噬菌體的相應幼齡(如腸道細菌,經6-8 小時培養)菌液3-4 毫升。在
(2)加熱法:
由于使用濾菌器過濾,常能吸附一部分噬菌體.若液體內噬菌體數量不多時,較難分離成功。而加熱法是根據噬菌體的耐熱性較一般無芽胞細菌高,故用較高的溫度將大部分細菌殺死,噬菌體仍保存著,經過多次反復,使液體中的噬菌體數量增多.最后經過濾器的液體則含有眾多的噬菌體。
分離過程如下:將5-10 毫升污水加至10-20加毫升肉湯內,混合后加熱
2 .噬菌體的鑒定
將已知菌密密地涂布于肉湯蛋白胨瓊脂平板表面上,取待測的噬菌體液滴于平板上,每板分成三等分,每份1 滴.在
3 .從貝類中分離純化噬菌體
現已知有100多種病毒可從人或動物腸道,或其他分泌物中排泄出來.而污染水源,而貝類動物及其他功物能聚集人類致病性病毒.不少學者報道在海水、海洋浮游生物、海產貝類和污水中發現,并分離出病毒。Moson 和Moclean( 1962 )證實了生牡蠣妨內存在著肝炎病毒。由于噬菌體對宿主有高度的特異性.則可利用其宿主作為敏感菌株去培養和發現它們,并根據其對宿主細胞的裂解,可在含有敏感菌株的平板培養基上出現可見的噬菌斑,且一個噬菌體產生一個噬菌斑,一種純的噬菌體具有相同形態大小的噬菌斑,故可將某種樣品中的噬菌體分離與純化。
(1)貝類樣品的處理:取三個活牡蜘,用自來水洗刷貝殼表面,洗凈后用無菌水洗三次。放于鋪有經高壓消毒的四層紗布的解剖盤上.取無菌解刻刀解剖其肉,無污染地研磨成漿,加無菌水100 毫升經離心(2000轉/分25分鐘)去沉淀。
(2)增殖培養:取前步驟的上清液,全部加雙倍濃度肉湯蛋白胨培養基100 毫升及所要分離的噬菌體的幼齡宿主,如大腸桿菌、痢疾桿菌或葡萄球菌等懸浮液2 毫升,于
(3)噬菌體裂解液的制備:
將增殖培養液以2500 轉/分離心15 分鐘,取上清液經蔡氏濾器過濾,并將濾液倒入另一個無菌的三角瓶中,置
(4)噬菌體的檢驗:上述濾液若無菌生長,可作有無噬菌體存在的檢驗,其方法如下:
① 將宿主菌懸液涂布接種于肉湯瓊脂平板培養基上。
② 待平板面菌液干后,按三等分各滴上1 小滴無菌濾液于平板上。將平板置于
③ 如已證明有噬菌體存在,可再將濾液接種于已同時接種有宿主菌的肉湯培養基內,如此重復移種數次,即可使噬菌體增多。
4.純化培養
(1)將含有噬菌體的濾液用肉湯液體培養基,按10倍稀釋法稀釋成
(2)向裝有4 毫升已融化的,保溫在
(3)待倒入的上層瓊脂凝固后.置于
(4)待出現噬菌斑后,用接種針在選定的噬菌斑刺一下,接種于含有宿主菌的肉湯培養液中,于
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