志賀氏菌是一種引起痢疾病的痢疾桿菌,由日本細胞學家志賀首先發現的,故將這一屬的細菌稱為志賀氏菌屬。根據生化反應、抗原的不同可分成四類:
① 志賀氏痢疾桿菌和斯米茨氏痢疾桿菌
② 弗氏痢疾桿菌
③ 博伊德民(Boyd )痢疾桿菌。
④ 宋耐(Sonnei )痢疾桿菌。
1 .培養基成分及制備
(1) G . N .增菌液:
胰蛋白胨
葡萄糖
甘露醇
枸櫞酸鈉
去氧膽酸鈉
K2HPO4
KH2PO4
NaCl
蒸餾水1000 毫升
pH 7.0
將上述各物溶于水中,加熱使溶解,校正pH 過濾,分裝于試管,每管5 毫升。在
(2)沙門氏,志賀氏菌屬瓊脂基(簡稱S .S .瓊脂):
膘蛋白胨
乳糖
膽鹽8.5
枸櫞酸鈉8.5
Na2S2O3·5H2O 8.5
枸櫞酸鐵
牛肉膏
瓊脂17
0.5%中性紅水溶液4.5毫升
0.1%煌綠溶液0.33毫升
蒸餾水1000毫升
將除中性紅和煌綠溶液外的其他成分煮沸溶解,調pH 為7.1 ,加入中性紅和煌綠充分搖勻,再煮沸l-2 次,用牛皮紙包好瓶門。冷至
① 此培養基切忌高壓滅菌,或加熱的時間過長。
② 配成平板培養基后.在接種前應先使培養基表面干燥,便于分離接種.一般的方法是倒放于培養箱l 小時左右,當日使用.
③ 此培養基質量的優劣主要是與膽鹽有關。要獲得比較滿意的結果.每批膽鹽購到后,選擇若干菌株,于實驗室內用S.S瓊脂作對照試驗。必要時可適當調節鹽類和膽鹽的用量。要求達到:
a .沙門氏菌屬和志賀氏菌屬均能生長,并保持在S.S瓊脂上應有的特征。
b .對大腸桿菌有一定的抑制能力.生長的大腸桿菌呈桃紅色。
c.無膽酸擴散沉淀現象。
④ 煌綠溶液配制后,應在10 天內使用,過久不宜使用。
( 3 )雙糖鐵瓊脂.
上層成分:血消化湯500 毫升
瓊脂
Na2S2O3·5H2O
FeSO4(NH4)2SO4·6H2O
乳糖
0.4%酚紅溶液2.5 毫升
下層成分:血消化湯500 毫升
瓊脂
葡萄糖
0.4%酚紅溶液2.5毫升
制法如下:
上層:
① 將血消化湯和瓊脂混合,加熱溶解,調pH 為7.8-8.0,用3-4 層的紗布過濾。
② 加入其他成分搖勻,使其溶解,裝入燒瓶中。
③ 在
下層:
① 與② 同上層的① 與② 步驟,但分裝試管中,每管2 毫升。
③ 在
凝固后.按無菌操作將上層培養基乘熱裝于下層培養基上面,每管約裝1.5毫升.制成斜面,待用.
2 .濾膜濃集
一般情況下,水中的志賀氏菌的數量不多,不容易檢驗分離出來,必須先通過濃集、增菌培養階段,而后再進行分離鑒別.
濾膜濃集法.適于澄清的水樣.取一定量的水樣。按分離基本技術中的超濾膜法進行。
3 .增菌培養
將濾膜的全部或部分放入G . N .增菌培養基,在
4 .平板鑒別培養
用少量的增菌液在S.S平板培養基上涂布均勻,于
5 .雙糖鐵斜面培養
挑選上述可疑菌落接種于雙糖鐵培養基,在
志賀氏菌的菌落和沙門氏菌相似,無色、半透明、邊緣整齊,但較小和較為透明些,且更扁平。宋氏志賀氏菌的菌落較大,邊緣較不整齊,且因遲緩發酵乳糖,在S.S.瓊脂平板上的菌落有時呈玫瑰紅色.所以供生化鑒定的菌落應多挑幾個以防遺漏.
6 .一般的生化鑒定
經雙糖鐵斜面培養,如果在底層葡萄糖產酸不產氣,無動力,不產生硫化氫,上層斜面乳糖不分解,則可視為可疑的志賀氏菌,可進行生化和血清學檢驗。
生化檢驗項目包括:葡萄糖、甘露醇,麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質、硫化氫、動力、尿素。志賀氏菌屬能分解葡萄糖、但不產氣(弗氏志賀氏菌b 型有時能產生少量氣體); 一般不分解乳糖及蔗糖(宋氏志賀氏菌對乳糖及蔗糖遲緩發酵產酸);志賀氏菌均不產生硫化氫.不分解尿素,無動力,對甘露醇、麥芽糖的發酵及吲哚的產生,則因菌株不同而異。在
如遇多價血清玻片凝集試驗為陰性,而生化反應符合上述情況時,可加做肌酵、水楊苷、V . P .、枸櫞酸鹽、氰化鉀等試驗,志賀氏菌屬均為陰性反應。吲哚產生陽性的無動力菌株.可加做5 %乳糖發酵管和葡萄糖銨試驗,志賀菌屬均為陰性。
7 .系統生化檢驗
表2-7 志賀氏菌屬的系統生化檢驗
靛基質 |
-/+ |
甲基紅 |
+ |
西蒙氏枸櫞酸鹽 |
- |
硫化氫(三糖鐵) |
- |
尿素酶 |
- |
氰化鉀動力明膠( |
- - - |
賴氨酸脫羧酶 精氨酸雙水解酶 鳥氨酸脫羧酶 |
-/+ d |
苯丙氨酸脫羧酶 丙二酸鈉葡萄糖產氣 |
- - |
乳糖 蔗糖 甘露醇 |
- +/- |
衛矛醇 水楊苷 側金盞花醇 |
d - - |
肌醇 山梨醇 阿拉伯糖 |
- d d |
棉子糖 |
d |
鼠李糖 |
d |
注.十90 %以上陽性;-90%以上陰性;( + )遲緩陽性;d 有不同生化型.十/-多數陽性:-/+多數陰性.少數遲緩陽性.
志賀氏菌屬的生化反應和抗原特性,有時產生變異.故必要時,按系統的生化特性作鑒定,凡符合表2-7 的菌株可鑒定為志賀氏菌屬。如果在水樣中檢驗到志賀氏菌,則該水質已受污染.視單位水樣中的志賀氏菌數量,可確定受病原菌污染的程度。