(十八)濾膜法分離檢驗水中大腸桿菌群
人們在檢查病原菌污染的飲用水、近海海水和水源水時,經常以檢查水中大腸桿菌的數量作為指標(我國《生活飲用水衛生標準》 規定:每升水中大腸桿菌不多于3 個,可作為飲用水。)來說明水受人畜糞便污染的程度。因水中由病人和病畜或帶菌者的糞便污染而來的病原菌數量很少.不易直接檢查,而水中的大腸桿菌群,如果超過一定數量.就說明被檢查水可能有病菌存在。實際上這種檢查過程,首先是應用選擇性培養基,將大腸桿菌群從雜菌中分離出來的一種過程。
其檢驗方法有兩種:一是發酵法,即根據大腸桿菌群具有能分解乳糖生成CO2等氣體的特性酶,而其他腸道細菌如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬,由于沒有這種特性酶,不能產氣,可被區別開來。另一種是濾膜法,它是利用細菌不能通過微孔性薄膜.在抽濾下液體濾過而細菌被截留在膜上.然后用具有高度選擇性的品紅亞硫酸鈉培養基(遠滕氏培養基)分離培養,本實驗將應用這種方法分離鑒定大腸桿菌群.此法較簡單而快速,發酵法較之繁雜,所需的時間也較長。
1 .培養基的成分及制備
(1)品紅亞硫酸鈉培養基:
蛋白胨
牛肉膏
酵母浸膏
乳糖
瓊脂
K2HPO
無水Na2SO3
5 %鹼性品紅乙醇溶液20毫升
蒸餾水1000毫升
(2)儲備培養基的制備:
① 將瓊脂加于800毫升蒸餾水中,加熱溶解后,加磷酸氫二鉀、蛋白胨、牛肉膏及酵母浸膏,混勻,溶解,以蒸餾水補足1000毫升、調pH 為7.2-7.4 。
② 趁熱用脫脂棉或絨布過濾后加入乳糖,混勻后定量分裝于錐形瓶中。包裝后于
(3)平板培養基的制備:
① 加熱溶化上述配制的儲備培養基。
② 據瓶內培養的數量按2%的比例吸5%鹼性品紅乙醇溶液注入無菌試管中.
③ 同樣按比例(5‰)稱無水亞硫酸納置于滅菌的另一空試管中煮沸10分鐘滅菌后,例入鹼性品紅乙醇液中混合后,全液加到以融化的儲備培養基內,充分混勻(防止產生氣泡)。
④ 立即將此液分裝于無菌培養皿中,制成平板培養基,冷凝后置于冰箱內備用,但不宜存過久。此種培養基專供濾膜法測定大腸桿菌群時用。據使用情況,培養基中鹼性品紅用最也可適當減少。
(4)乳糖蛋白胨半固體培養基成分及制法:
蛋白胨
牛肉膏
酵母浸膏
乳糖
瓊脂
蒸餾水1000毫升
將上面各成分放于水中加熱溶解混勻,調pH 為7.2-7.4 ,過濾,分裝于小試管內,置高壓蒸汽鍋內,
2 .濾膜與濾器的滅菌
(1)將濾膜放入燒杯中,加入蒸餾水, 于沸水溶中煮沸滅菌三次.每次15 分鐘。前二次煮沸后需換水洗滌2-3 次,以除去殘留的溶劑。
(2)濾器滅菌,用點燃的酒精棉球火焰滅菌,也可用紗布和牛皮紙包裝好于
3 .分離培養
(1)過濾水樣(海水、飲用水、自來水,水庫水及各種水源水),用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣,使粗糙面向上,貼放于已滅菌的濾器上,穩妥地固定好濾器,將水樣注入濾器內,加蓋,打開濾器閥門.在負0.4 大氣壓下抽濾,水樣抽完后,再抽氣5 秒鐘,關上濾器閥門,取下濾器。
(2)用滅菌攝于夾濾膜邊緣,移放在平板培養基上,使濾膜的截留細菌面向上,另一面完全緊貼培養基,兩者之何不得留有氣泡,重復以上的步驟,再接種一、二個平板.倒置培養皿于
(3)觀察。挑選符合下列特征的菌落涂片,革蘭氏染色鏡檢。
紫紅色,具有金屬光澤的菌落.
深紅色,不帶或略帶金屬光澤的菌落,
淡紅色,中央色較深的菌落。
④ 凡屬革蘭氏染色陰性、無芽孢桿菌,應將其穿刺接種于乳糖蛋白胨半固體培養基(接種前須將此培養基放在水溶中煮沸排氣,待冷凝后使用),經