（十三）鐵細菌富集分離及形態觀察

能接觸性地加速重碳酸亞鐵〔 Fe ( HCO3）2〕 溶液中的Fe2+氧化成Fe3+,從而引起氫氧化鐵沉淀產生的細菌叫做鐵細菌。它們不但存在于含鐵的泉水、沼澤地、湖泊和流水緩慢的河床和水稻田中，而且生存在海底淤泥、海水和湖中，如赭色絲細菌（赭色纖發菌）、多孢泉發菌（多孢鐵細菌）、含鐵嘉氏鐵柄桿菌（鐵銹色披毛菌）、絲藻鐵單胞菌（絲藻鏈球鐵細菌）等。

1.鐵細菌的增菌培養

（1）增菌培養基成分及其配制：

① 海水稻草浸出液，取稻草少量加海水煮沸，去稻草，取上清液加海水調成淺黃色即成．

② 稻草增菌培養液：

稻草浸出液  90毫升

鐵片1 小塊（或小鐵釘l 支）

稻草浸出液于121 ℃ 蒸汽下滅菌20分鐘，將鐵片或小鐵釘包好置160 ℃ 干熱滅菌60 分鐘，待冷后放入浸出液中即成。

③ Winogradsky 鐵細菌培養液。

NH₄NO₃    0.5克

NaNO₃  0.5克

K₂HPO₄   0.5克

MgSO₄·7H₂O   0.5克

CaCl₂·6H₂O  0.2克

檸檬酸鐵銨  10克

水1000 毫升

分裝于燒瓶中，每瓶50 毫升，121 ℃ 蒸汽滅菌20 分鐘。如果在滅菌前加瓊脂15 克．可作為固體培養基。

（2）接種培養與鏡檢：取含有機酸表層海泥各l 克，分別接種于上面兩種增菌液中．培養瓶塞緊，放于暗處，18-20℃ 下，培養2-10 天，如有松軟的灰色絮花出現，而后轉變為赭黃色時，將其挑取少許制成水浸片，在顯微鏡下觀察，可見到赭色纖發菌和含鐵嘉氏鐵柄桿菌等．取下玻片，在蓋玻片的一邊加2%K₃Fe（CN）₆。和10%鹽酸各1 小滴，從另一邊，用吸水紙吸去多余水分，再置于顯微鏡下觀察其形態．若菌絲或粘液變為藍色，證明有鐵的沉淀物．即三價鐵與黃血鹽作用形成普魯氏藍，所鏡檢的細菌為鐵細菌．

 2 ．鐵細菌的分離與純化

（1）培養基的成分及其配制．

① 亞鐵桿菌屬液體培養基：

a ．無機培養液：

( NH₄ )₂SO₄   0.15克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.50克

K₂HPO₄   0.05克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸餾水   1000毫升

把以上鹽類溶于蒸餾水中，分裝于燒瓶，每瓶90毫升，于121 ℃ 蒸汽下滅菌15 分鐘，即無機培養液。

b ．母液    

FeSO₄·7H₂O   10 克加蒸餾水至100 毫升，過濾除菌即成。

c ．液體培養基   

每90 毫升無機培養液加10 毫升母液，搖勻，最后為乳白色的混合液．冷藏不致氧化，備用。

② 亞鐵桿菌固體培養基：

a.無機培養液

( NH₄ )₂SO₄   6.0克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.50克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸餾水   250毫升

將以上無機鹽溶于蒸餾水中，分裝于125 毫升的錐形瓶中，每瓶25 毫升，于121℃ 蒸汽下滅菌15 分鐘，備用。

b ．緩沖液：溶13 .5 克磷酸氫二鉀于100 毫升蒸餾水中，單獨滅菌待用。

c.硫酸亞鐵溶液：制法同液體培養基母液。

d ．硅酸溶膠：用蒸餾水將濃鹽酸（比重1.19）的比重調至1.10 （每100 毫升濃鹽酸大約須加蒸餾水100毫升）。另以蒸餾水把市售的水玻璃的比重調到1.06-1.08，取等量的兩液，將后液傾入前液，不得反之。兩液充分混勻后，用鹽酸調pH 為2，分裝于試管和燒瓶，于110 ℃ 下滅菌25 分鐘，燒瓶中培養基傾注成平板，試管的擺成斜面（或立即倒入直徑10厘米的培養皿，每皿30 毫升，靜置1 天凝成平板）。

e．固體培養基：取1 毫升硫酸亞鐵溶液于75 毫升硅酸溶膠中，另取l 毫升無菌磷酸緩沖液加入25 毫升的無菌鹽溶液中，混合此二液．搖勻后傾注成平板，靜置24 小時使其凝膠化。

若預先把硅酸溶膠在平皿上凝固成平板．則把其他三種溶液混勻后，取混合液2 毫升均勻地分布在硅酸膠平板上，在50 ℃ 下烘至平板上無水流動。不宜過干，以免平板破裂。為保持培養基潮濕，可在皿蓋上放一張濕濾紙．

③ 嘉氏鐵柄桿菌的無機培養液．

( NH₄ )₂SO₄   1.5克

KCl    0.05克

MgSO₄·7H₂O   0.05克

K₂HPO₄   0.05克

Ca ( NO₃）₂   0.01克

蒸餾水   1000毫升

 將以上的無機鹽溶于蒸餾水中，調pH 為6.0，分裝于100 毫升的三角燒瓶中，每瓶裝2 厘米高．121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鐘。冷后加入預先封閉在試管中、單獨以160 ℃ 干熱滅菌1 小時的大粒軟鐵屑0.05克．為使生長良好，可加無菌的重碳酸鐵〔 Fe（HCO₃）₂〕 1%量，即可接種。

④ 嘉氏鐵柄桿菌固體培養基：配制法基本上同亞鐵固體培養基。只是把液體培養基中的（NH₄）₂SO₄改為6 克，將FeSO₄·7H₂O母液換成Fe ( HCO₃ )₂母液，其他配方及方法均相同。

⑤ 纏繞纖發菌液體培養基：

KNO₃     1 克

K₂HPO₄   0.1克

MgSO₄   0.1克

FeSO₄   0.01克

蒸餾水1000毫升

將4 種無機鹽按順序溶于蒸餾水中，調pH 為6，分裝于100 毫升的燒瓶中，每瓶液高約2 厘米。于121℃ 蒸汽中．滅菌20 分鐘。

⑥ 纏繞纖發菌固體培養基：

a .無機培養液    即用其液體培養基。

b . 母液   用1%硫酸亞鐵溶液．

c .緩沖液    同分離亞鐵桿菌的緩沖液。

d ．硅酸溶膠    同分離亞鐵桿菌的硅酸鹽溶膠。但凋pH為6。

e ．固體培養基   各液的比例及配法同上述。

（2）接種分離培養：取增菌中的菌濃或待測樣品（海泥或海水）少許．分別接種于上述各種培養液中，并各做無接種的對照瓶，一起放于同樣條件下培養．嘉氏鐵柄桿菌置于6 ℃ 下培養。纏繞纖發菌于8 ℃ 中培養，亞鐵桿菌置于10 ℃ 左右培養．均至有明顯生長為止．

① 平面分離：取液體培養物涂抹于相應的平面上，置于適溫下培養至長出明顯菌落。觀察菌落形態，并做鏡檢。

② 純培養：挑取單個菌落中央菌苔，于斜面劃線，在適溫下培養，長出后放于-5 ℃ 以下的冰箱中保存。備用。

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