（七）硫桿菌的分離培養

硫桿菌屬 ，能使硫或硫酐的不完全氧化物轉化成硫酸等物質，并參與水中和土壤中硫的循環作用．使土壤和水質改良．當水中積累硫化氫等有毒物質時．可在硫桿菌的作用下轉化為無毒物質，利于水產養殖．

硫桿菌在海水、淡水、海泥、池泥及其他土壤中廣泛分布。具有代表性的有排硫桿菌、氧化硫桿菌和脫氮硫桿菌等。

1 ．排硫細菌的富集培養與分離

此種細菌能在添加硫化鉀或硫代硫酸鈉．而無有機碳源的海水中生長．少許有機物也不抑制其生長．但在沒有二氧化碳及碳酸鹽情況下不能生長。在大量硫化物存在下，硫化物被氧化成硫沉淀于細胞外，此種細菌能氧化硫元素，但較嗜好氧化硫化物、硫代硫酸鹽或四硫磺酸鹽．氧化不同的硫化物，產物也不同，視作用物的濃度、pH 、En而定．

（1）培養基制備．

Na₂S₂O₃·5H₂O    2 克

K₂HPO4    0.8克

KH₂PO4    0.5克

NH₄Cl    0.08克

MgSO₄    0.16克

FeSO₄    微量

MnSO₄    微量

水    200 毫升

pH  7-7.8

此培養基選擇性強，可不必滅菌。其固體培養基用雙倍用量加2-3 克瓊脂及等量的水制成平板培養基，用紫外線消毒即可。培養基中的微量組分，預先配成稀的水溶液，先滴l 滴在培養皿或錐形瓶中與培養基混勻．

（2）富集培養：將已配制液體培養基分裝于4 個150毫升的錐形瓶中，取不同站位的粘海泥或池泥、河泥2-3 克，分別接種于裝有培養基的瓶中，每個樣品接種2 瓶，振蕩均勻。在25-30 ℃ 下培養3-4 天。此后培養液變酸，變濁，一星期內，pH 由7.3 降為3 ．則可估計出培養液中的排硫桿菌繁殖起來已占優勢．

（3）分離培養：挑各瓶培養液分別接種于相應編號的平板培養基上，加1 滴無菌水，用曲玻棒涂勻，倒放培養皿于25-30 ℃ 中培養1-2 天，若出現不透明的白色或淺黃色的菌落則繼續培養，較大的菌落中央呈橙色小圓點。如不純，可挑選具有這些特征的菌落作涂板純化，菌落為圓形，大小約0.2 毫米．全緣，由于有硫粒的積集，內部呈粗粒狀結構。

（4）顯微觀察：呈細短桿菌，大小為0.5×1-3 微米，無孢子，能運動，呈革蘭氏陰性反應。

若備有上述各種特點者可初步應定為純的排硫細菌。

2 ．氧化硫桿菌的富集培養與分離

此種細菌能氧化硫元素為硫酸鹽：

① 培養基制備：

硫黃末   2 克

(NH₄)2SO4  0.04 克

KH₂PO₄    0.8克

MgSO₄·2H₂O  0.10克

CaCl₂  0.05克

FeSO₄   微量

水200 毫升

pH 2-3.5

將上述成分溶于水中混勻后，加克分子濃度的磷酸若干，使pH 降至3 左右。由于培養基的酸度高可不需要滅菌,同樣用雙倍濃度上述成分（也即將水減至100 毫升）加2-3 克瓊脂制成平板。

(2）富集培養：按排硫桿菌的培養方法和條件進行．因海泥是微堿性的使pH 提高到5.2 左右，培養2-3 天或更長時間后，培養液出現混濁現象，變酸。一周后pH 由5.2 降至3.7 ，二周后pH 變為2 或更低些，由此可故計這種氧化硫桿菌在培養液中已有大量繁殖。取此培養液少許重復富集培養2-3 次，可獲得更大量氧化硫桿菌供分離之用．

（3）分離純化培養：在已重復富集培養數次的培養液中加硫酸溶液使pH 降至1 或更低些，借此淘汰雜菌，以純化氧化硫桿菌。

（4）各取少許上述培養液分別在平板培養基上涂板，并按排硫桿菌的培養條件與方法培養l-2 天后觀察菌落形態。

（5）顯微觀察：細短桿菌，大小約為0.5×1.0微米，菌體兩端圓形，單一。成雙或呈短鏈排列，無孢子，革蘭氏染色陰性反應．運動活潑．

符合上述特征者，所分離的細菌可初步確定為氧化硫桿菌。

3 ．脫氮硫桿菌的富集與分離

（1）培養基制備：

Na₂S₂O₃·5H₂O    1.0克

K₂HPO₄   0.4克

KNO₃      0.4克

NaHCO₃  0.2 克

MgSO₄·7H₂O   0.12克

NH₄Cl  0.1克

FeSO₄·7H₂O    0.002克

水     200毫升

pH    7-7.6

固體培養基用雙倍濃度（即將減至100 毫升）加瓊脂2-3 克，可用紫外線滅菌。

（2）富集培養：按排硫桿菌的培養方法和條件進行，2-3 天后培養液出現均勻混濁，并有氣體從瓶底的沉淀物中陸續上升，由此二種現象可估計培養液中己繁殖不少的脫氮流桿菌，分別將此培養液逐個傾出后，再用新的培養液充滿培養瓶，如此重復直至傾入新培養液時，立即見氣體從瓶底培養物中逸出，至此可認為培養液中已有足夠多的培養菌。

（3）分離純化培養．按排硫細菌分離方法把培養液分別接種于相應編號的平板培養基上，顛倒平板與焦性沒食子酸同時放入干燥器中，抽出空氣，充以CO₂，培養1 周左右．觀察菌落形態為半透明的圓形小菌落時，取少許菌落重復子平板培養基上作純化培養。

（4）顯微觀察：細小桿菌，大小為0.5×1-3 微米，革蘭氏染色陰性．無孢子，能運動。

能觀察到上述各種特征者，可初步確定為脫氮硫桿菌。

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