（五）硝化細菌的富集培養和分離

海洋、港灣、湖泊中的腐生細菌可以把動植物體分解成為氨或氨基酸，固氮菌等可將游離氮變成氨。而生長在水環境中的硝化細菌卻能把氨或氨基酸轉化為硝酸鹽．如此生成的硝酸鹽，正好是浮游植物必要吸收的有機營養物．氨在微生物作用下氧化成硝酸鹽有兩個過程，一是在亞硝化單胞菌屬等一類亞硝化菌的作用下，使氨氧化成亞硝酸鹽的過程．是一種放熱反應，這個反應降低了熱力電勢，在25 ℃ 下放出59400卡克^-1熱量；另一過程是由硝化桿菌屬等氧化亞硝酸鹽成硝酸鹽，并放出18000卡克^-1熱量：

 1 ．亞硝化細菌的富集培養

( l ）富集培養基配制．

( NH₄ )₂SO₄   0.2克K

K₂HPO₄    0.1克

MgSO₄   0.05 克

NaCl  0.2克

FeSO₄  0.04 克

CaCO₃或MgCO₃  0.5克

水100 毫升

pH 7.2

除CaCO₃或MgCO₃外，將其他成分溶解于水中，分裝入錐形瓶，視瓶容量，每瓶裝30-50毫升，液層厚約1厘米左右即可，而后按0.5%比例加入CaCO₃或MgCO₃．塞上棉塞，包裝好，在121 ℃ 蒸汽下滅菌2O 分鐘備用。

（2）用取樣器取近岸的富有機質的軟海泥及污池泥或污溝軟泥各1 份．各取少許泥樣接種于錐形瓶中混勻。每個樣品接種2 瓶，置20 ℃下培養7-10 天。

（3） NO₂^- 壓的測定．在白色比色板的凹窩內加3 滴鋅-碘-淀粉液，滴入20%的硫酸，加培養液2 滴，如有NO₂^-存在立即出現藍色．這證明培養基中的NH₄⁺ 經亞硝化細菌作用已轉化成為NO₂^- ，即有亞硝化細菌存在。也可用奈氏試劑檢查有無氨態氮存在。若沒有氨態氮存在，說明NH₄⁺ 已被氧化為NO₂^- ，這也證明了亞硝化細菌的存在．另用未接種培養基作對照。若以陳海水為培養基的溶液時，由于海水含有NO₂^-  ，對照管也呈NO₂^- 陽性反應．這時可延長培養時間，檢查NH₄⁺ 的消失，但應注意實驗室的空氣中常常有氨態氮的存在。

（4）當所有的氨被氧化后，在培養液中加1 毫升10%的( NH₄ )₂SO₄   ，如此重復幾次．直到培養液中的亞硝化細菌很多為止。

2 ．亞硝化細菌的分離與純化

（1）硅酸膠平板培養基的制法：用蒸餾水（約50 毫升）將比重為1.19的50 毫升濃鹽酸調到1.10，再用蒸餾水將市售的水玻璃的比重調到1.06-1.08 ．將調好的水玻璃100 毫升倒入上液（不得反過來倒）．兩液混勻后立即分裝于直徑10 厘米的培養皿內，每皿裝30 毫升，倒6 個平板。靜置1 天，凝成平板后．用緩慢的流水漂洗3 天．至氯離子完全消失。用無菌水淋洗兩次，傾去多余的水分即成硅酸膠平板．

將上述采用的培養基成分用量的一半加入20 毫升蒸餾水中溶解滅菌．每個硅酸膠平板加2 毫升此種培養液，輕輕轉動培養皿，使培養液分布均勻。打開皿蓋，在50 ℃ 下烘至平板表面沒有流動水為止（過干會使硅膠平板破裂）。

（2）取富有機質的近岸海泥，污池軟泥和污溝軟泥樣各少許點種于平板表面，三種樣品各點種2個平板。為保持平板的水分，可在皿蓋上放一張濕濾紙或將培養皿放在28-30℃ 的濕室內培養15-30 天。由于硅酸膠平板有高度的選擇性，在點樣周圍長出的都是亞硝化細菌。可挑此菌落于斜面培養待用。

3 ．硝化細菌的富集培養

自然界中除自養菌能進行硝化作用外，近年來也報道了很多異養菌的硝化作用。許多異養菌能在含按鹽的培養基中產生微量的亞硝酸。而某些真菌還能在培養基中氧化亞硝酸。即此二類微生物在一起能把銨轉化為硝酸。

① 富集培養基的制備．

NaNO3  1 克

Na2CO3（無水）1 克

NaCl   0.5 克

K2HPO4   0.5 克

MgSO4   0.5克

FeSO4  0.4 克將這些藥品溶于1000毫升水中．分裝于1000毫升的錐形瓶中，于121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鐘，備用。

（2）用3 個取樣器分別取近岸有機質半富的海泥、河口軟泥、污池泥。

（3）三種樣品各取少量，分別接種于培養基中混勻，在20-25 ℃ 下培養5-7 天．

（4）根據亞硝酸鹽的消失，硝酸鹽的形成，可驗證細菌硝化作用過程第二階段的存在。亞硝酸鹽的消失可用格里斯（Griess ）試劑或鋅-碘-淀粉溶液測定．用后者測定見前述，用前者測定，即加格里斯試劑（也稱亞硝酸試劑）甲、乙液各2 滴于白瓷盤的凹窩，再加待測的培養液l 滴，如果亞硝酸鹽被氧化完畢，則顏色不變，證明了硝化細菌的存在。也可將新鮮（無接種）的培養液作對照，這時未接種培養液反應為紅色，即有亞硝酸鹽的存在。

硝酸鹽的測定，即在白瓷凹窩中加濃硫酸和二苯胺試劑各2 滴，如出現藍色說明亞硝酸鹽培養基在硝化細菌的作用下，已被氧化成硝酸鹽．另外用未接種培養基作對照．

（5）培養液中的亞硝酸鹽被氧化完全后，加入10%亞稍酸鈉溶液5 毫升，重復幾次上述的實驗后，可獲得富集硝化細菌的培養液。

4 ．硝化細菌的分離純化

( 1 ）試驗步驟如下：

① 利用前述富集培養基配方加入1.5-2%瓊脂，制成固體平板培養基．

② 取上述三種樣品各5 克，分別加入5 毫升無菌水（海水樣品用無菌海水）中．搖勻，各取上清液0.1毫升接種于平板上，每種樣品各接種2 份，或用硅酸膠平板分離（見亞硝化細菌分離）。分離的菌落可接種于斜面培養基上培養，待用。

（2）試劑配制：

① 鋅-碘-淀粉試劑的配法：將25克氯化鋅溶于25 毫升蒸餾水中，l 克淀粉溶于少量水，兩液混合煮沸至淀粉溶解后，加入0.5 克碘化鋅，蒸餾水加至250 毫升即成（制成的溶液應是無色的）．保存于棕色瓶中待用。

② 奈氏（Nessler ）試劑的配制法，奈氏試劑（也稱氨試劑）為碘化汞與碘化鉀復鹽（HgI·2KI ）的堿性溶液，其配法有多種，現介紹一種如下；

a ．甲液:碘化鉀10 克、蒸餾水100 毫升、碘化汞20 克。

b ．乙液：氫氧化鉀20 克、蒸餾水100 毫升。

分別按上列配方制備甲、乙兩液。待冷后．將兩液混合保存于暗色瓶中備用。為加速溶解，碘化汞可預先放在研缽中加幾滴碘化鉀研碎．

③ 格里斯（Griess ）試劑配制：其配方有幾種，現介紹常用的一種：

a ．甲液：對氨基苯磺酸（即磺胺酸）0.8 克、5N 醋酸( 1 份冰醋酸加2.5 份水）100 毫升，配時不能加熱溶解．

b ．乙液：α-奈胺0.5 克、5N 醋酸100 毫升．加熱溶解。

同時把甲、乙兩液等量混合，但混合液不能較長時間保存。

④ 二苯胺試劑配法；二苯胺1.0克溶在20 毫升蒸餾水中，然后徐徐加入濃硫酸100 毫升即成，保存在棕色瓶中備用。

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