（三）海洋發光細菌的分離培養

發光細菌所發的光是冷光，在轉變化學能為光能中。效率接近百分百．所以發光細菌是研究光源材料之一，細菌燈可作為危險品倉庫的照明，在細菌發光時絕對需要氧氣，故可應用于低濃度氧的測定，發光細菌也可用于毒物和抗菌素的測定，將來還可能用于宇宙航行時對地球外的生命物質的探測。海洋發光細菌既可從魚的體表、內臟，發光器官分離而得，也可從海水或河口水及其沉積物中分離得到。發光細菌在新鮮的海洋魚類體表多于腐敗的魚體。魚體一旦腐敗，腐生菌繁殖很快．并且取代發光細菌。故分離發光細菌時要用新鮮魚或其他新鮮海洋動物。典型的發光細菌是筒狀細菌，大小約1.1×42.2微米，也有球狀和弧狀，又分單極鞭毛和周生鞭毛，多數為革蘭氏陰性菌．我國已分離的發光細菌目前有四種。

1 ．增殖培養

（1）取一條新鮮魚，放在無菌的大培養皿內，向魚體上倒入無菌的3 %食鹽水，使液面高度在魚體腹線處．不可將魚體完全淹沒。將魚的內臟拉出用無菌剪刀剪開胃腸．取出內含物放于無菌培養皿中，同樣加入無菌的3%食鹽水．不淹沒魚內臟，浸入二分之一即可。

（2）置于15 ℃ 溫箱中培養l-2 天后，在微暗處觀察。魚體表面微弱的亮點便是發光細菌，則應及時挑出分離，否則腐生菌滋長，而發光菌就會消失。

2 ．第一次分離

（1）雞蛋培養基的制備，將一個雞蛋的蛋白及蛋黃全部倒入燒杯中，加入3%食鹽水100 毫升，攪勻，分裝于培養皿中；每個培養皿約倒15-20毫升，在121 ℃ 的蒸汽下滅菌30 分鐘。

（2）在黑暗處用接種環分別從魚體表面和魚內臟內含物上的亮點處挑取少許亮度較大的發光細菌菌落。在雞蛋培養基上劃線分離，挑取亮度較弱的菌落分別在另兩個雞蛋培養基上劃線。

（3）在15 ℃ 溫箱中培養1-2 天，則可在培養基表面看到發光細菌的菌落。此時發光細菌菌落中發光細菌己占優勢，但還混有許多腐生紐菌。若不及時分離純化．由于腐生細菌的大量繁殖會抑制發光細菌生長。最后，將取而代之。

3.第二次分離

（1）蛋白胨牛肉膏的制備；

蛋白胨1 克

牛肉膏l 克

K₂HPO₄   0.1 克

MgSO₄·7H₂O  5 克

NaCl   3 克

瓊脂1.5-2.0克

將以上物質加蒸餾水至100 毫升，混勻，加熱溶解，調pH7.4 ，于121 ℃ 蒸汽壓下滅菌30 分鐘。冷至45 ℃ 后分裝培養皿上，制成平板培養基．

（2）在黑暗處分別挑選培養基上發光細菌菌落少許，在平板培養基上劃線分離。

（3）在15℃ 溫箱中培養1-2 天，則可看到單個的發光細菌菌落。

（4）挑取各種菌落少許分別涂片，各用革蘭氏染色法和鞭毛染色法染色，觀察其菌落形態。

（5）若形態一致可視為純種．選亮度較強的．不同形態的菌落移種于斜面培養基上．在15℃ 下培養1-2 天保存，供其他研究．若不是純種應繼續作劃線分離培養，直到純化。

（6）將純的發光細菌接種到蛋白胨液體培養基中，在15℃ 溫室內振蕩培養l-2 天，便可得到大量發光細菌的懸液。（若在300 毫升錐形瓶內有100 毫升發光細菌的懸液，發光細菌的亮度在暗處足以照清一般報紙上的字跡．

4 ．其他分離法培養基

（1）甘油碳酸鈣培養基：甘油1.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨2.0%、NaCl 3.0%，CaCO₃0.5%，pH6.9 .

（2）酵母膏蛋白胨培養基．酵母膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl3.0%，pH6 .9

（3）蛋白胨天冬酰胺培養基：蛋白胨1.0%、天冬酰胺0.5%，NaCl 3.0%、K2HPO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH6.9 .

（4）蛋白胨酵母膏甘油培養基：

蛋白胨5 克

酵母膏1 克

甘油3 毫升

瓊脂15 克

人工海水1000毫升

曾用廈門港灣水1 毫升注入無菌培養皿，倒入冷至45 ℃ 的此種蛋白胨酵母膏甘油培養基．搖勻后，置于室溫（24 ℃ 左右）下培養1 天以上可分離到發光細菌，重復性良好。另將此培養基制成平板，用鮮魚的內臟或腮直接在上面劃線也都能分離到發光細菌。

注：人工海水：NaCl  20.0克、MgCl₂· 6H₂O  7.2 克、MgSO₄·7H₂O  3.6 克CaCl₂·H2O 0.7克，蒸餾水1000 毫升．

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