（三）平板劃線法

劃線的方法很多 ，此法主要是用接種環挑取菌液或菌苔，或者用動植物體表小塊直接在平板培養基上劃線使上面的微生物逐漸分散于培養基上，達到單細胞分散而長出純菌落。此法少驟如下：

（1）取環樣品懸液，或少許菌苔或小塊生物體表或者內臟殘余物在表面無冷凝水的平板培養基一側反復涂片約1厘米寬帶。

（2）灼燒接種環，將接種環接觸培養基邊緣使之冷卻后．使接種環與平板培養基輕輕接觸與平板成30度角左右．從涂菌處在一側劃出2-3 條平行線．不通過涂處再劃2-3 條線，靠近前2-3 條的平行線，劃線時不使接種環接觸培養皿，不要劃破表面，伸到培養基內。

（3）灼燒接種環，然后通過原劃線劃出與之成70-80°角2-3 條平行線，連續劃2-3 條不通過原劃線的平行線。

（4）按此法反復劃幾組平行線，直到劃滿平板為止．

 （5）倒放平板于20-30℃下培養至長出明顯的菌落為止。若得不到由單細胞長出的純菌落，可再挑取長出的菌落，重復此法再劃線分離，最后挑取純種接種于斜面培養基上。

（四）倒平板法和平板涂布法

1 ．倒平板法

（1）按前面無菌操作法吸取已搖勻的適當濃度稀釋液1 毫升或0.1 毫升，用左手拇指和食指夾住無菌培養皿蓋，其他三個手指和手掌托住培養皿蓋底（預先貼明稀釋度標簽），用拇指和食指撐開培養皿蓋。注意開口不能太大，否則易染菌，并必須在火焰邊，開口不能對著鼻孔，以免呼吸時將雜菌吹入培養皿內．伸進移液管．注入稀釋液，。隨后關下培養皿蓋．

（2）右手取己融化冷至45 ℃ （溫度過高會使接種物燙死，溫度低培養基將凝固）的適宜的培養基管，左手拔出棉塞，在火焰上灼燒試管口，旋轉幾次。但不可燒得太熱，否則當培養基倒出時管口破裂。左手拿已注有稀釋濃的培養皿，用食指和拇指在火焰邊同前步驟稍撐開培養皿蓋。用右手把試管中培養基傾入。立即將培養皿蓋好，放在桌上旋轉幾次，使接種物均勻地分布在培養基中．冷凝后倒放。重復此步驟，視需要再接種幾個稀釋度，利于長成單個菌落。如果每個稀釋度接種兩份，也可應用于計數。注意吸稀釋液時，如果沒換新的移液管，必需用相同稀釋度的移液管．

（3）倒放平板，于適溫下培養。由于這種方法是先注入樣品，而后倒45 ℃ 培養基。由實驗結果證明這種溫度能傷害水生微生物，故用平板徐布法效果較好．

2 ．平板涂布法

（1）用右手拿移液管，照無菌操作法吸取一定濃度稀釋液0.01 -0.1毫升。左手拿貼有相應稀釋度標簽的，裝有選擇性培養基的培養皿．用拇指及食指稍撐開皿蓋（開口不宜太大．并不能對著鼻孔），在火旁注入移液管中的稀釋液

（2）放下移液管，取玻璃刮刀在火焰上灼燒滅菌后．于火焰旁在皿邊接觸無接種物的培養基，以加速玻璃刮刀冷卻，但不能把培養基燙溶化或刮破．隨后將接種物在培養基上涂布均勻（如果有旋轉涂布臺，將平板培養基置于臺上涂布．較快速而均勻）．不可將培養基涂破，蓋好培養皿。

（3）重復上述步驟，視實驗要求再接種幾個不同濃度，以便形成單個菌落。便于挑選分離．如果每種濃度接種兩個平板培養基，可應用于計數。

（4）將接種后的培養皿倒置．于適溫下培養，觀察，要注意當水中含總菌數，或所需的分離菌數量少時，需增加接種水樣的數量。不宜用涂布法。

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