分離與純化培養

（一）器具及設備

1 ．試管

微生物分離主要是在斜面培養基上進行，利用普通化學所用的試管即可，但管壁要厚的好，太薄的，在塞棉塞時易破裂。有的試管配有塑料蓋或鋁蓋，用于需要進行封管培養的，更方便。

2 ．培養皿

在分離微生物中，培養皿是用于平板培養．最好是用直徑為9 厘米左右的培養皿。一般是玻璃制成的．七十年代以來國外已有出售滅過菌的塑料培養皿．在一次需要大量培養皿時（如出海調查時）很方便。但這種培養皿用后，若再用高壓蒸汽滅菌等，會縮小而且易固結，所以用后可廢棄。

3 ，接種環和接種針

這是微生物接種時的主要用具，在分離中主要用于挑取培養物或樣品、在平板培養基上劃線及挑取平板上的菌落接種于斜面培養基上。實驗用的接種針，一般為4-5 厘米長鎳鉻合金絲制成，可分為環、耳、線和鉤四種。如果用白金制成的稱白金耳、白金線、白金鉤和盤繞接種環。白金耳頂上的圓環的直徑以2 毫米左右為準。所謂一環的接種量，就是表示接種的大致菌量．所以接種環不宜做得過大或過小。接種針或鉤是用于挑取細小菌落接種分離，接種針則用于穿刺培養。白金制成的接種針或環的優點是性質穩定。對微生物無毒否作用，加熱后能迅速冷卻，也不會因為接觸培養基中的化學藥品而遭損壞．但白金價格昂貴．

4 ．玻璃刮刀

它是用直徑為3-4 毫米的玻璃棒彎曲成三角形而成的。使用時，應使它與培養基平面成30-60^。角將滴加在瓊指平板上的樣品涂布均勻，使其長成單個菌落．作分離或培養計數．觀察菌落形態之用。使用前必須用牛皮紙或鋁箔之類包上進行干熱或濕熱滅菌，如果是供計數用的，則涂布一個平板須用一支刮刀，若用同一刮刀時應在火焰上滅菌，持于火焰邊待冷后再涂布第二個平板。

5 .轉臺

旋轉涂布臺是將培養皿放在旋轉臺上，開動馬達使其旋轉，用刮刀接觸瓊脂平面．則樣品很快地被涂布均勻，故使用這種裝置作平板涂布分散樣品的操作非常方便，可提高工作效率。

6 ．酒精燈或煤氣噴燈

這兩種燈的火焰使其周圍的微生物的燒死，熱死，在一定空間造成相對性的無菌場，便利無菌操作。同時可用火焰燒死粘于接種環或針、試管口、瓶口等的微生物，以免感染雜菌。一般，火焰大些好。因此分離接種都得在火焰旁進行操作。

7 ．接種箱或超凈工作臺

分離微生物時，如果不是在無菌室進行，必須配備接種箱。接種箱在分離接種微生物前必須用化學藥物消毒，或使用箱頂上的紫外燈預先滅菌口超凈工作臺是利用鼓風機將空氣經過濾裝置濾去微生物后從工作臺面吹出．工作臺使用前須先用70%酒精或其他化學藥物消毒擦凈。在使用接種箱及超凈工作臺時，能同時用酒精燈或煤氣燈，就能更好地保證不染菌。超凈工作臺使用前需先開動一定時間使原來在工作臺內部的微生物吹出工作臺以外，才能造成工作臺上無菌。

8 ．其他

分離微生物時．除了上述器具設備外，還需要試管架或金屬絲籃．一次可裝大量的試管，用起來方便；棉塞，分離好氧或兼性好氧菌時使用；試管蓋，有鋁制品，也有塑料制品；石蠟，用于分離培養厭氧菌，封固試管或厭氧裝置，防止空氣進入；還有稀釋樣品用的移液管、燒杯、三角瓶，玻棒，量筒、臺稱、鑷子、毛細管、顯微鏡、載玻片、顯微操縱器、超濾膜裝置等等。

 

（二）十倍稀釋分離法

在河泥、池泥、海泥和含有機物較豐富的河水、池水、污溝水，水庫水、近岸海水、港灣水、河口水中的微生物數量及種類，都相當多，要分離出其中某種微生物，必須用無菌水或無菌海水將水樣或泥樣稀釋，加吐溫80，使微生物成單細胞地分散于水中，制成具有一定稀釋度的微生物懸浮液，而后取一定量的懸浮液接種分離于平板培養基上，培養形成單菌落，進而挑選菌落作純培養．若樣品是附著的．則應先將附著物刮于無菌水或無菌海水中，而后稀釋分散… … 。但有的樣品并不是直接來源于上述的自然界，而是從保藏的斜面生長物取得，也可先將斜面上的菌臺刮下，稀釋分散，照樣取懸浮液接種，分離、傳代、復壯等，上述的稀釋分散的分離法正與本節（六）將談及的，與從含有機物稀薄的遠洋水、泉水和深層貧質的沉積物中．應用超濾膜分離微生物的濃集方法相反。

常用的稀釋法有十倍稀釋法等，此法常用于細菌平板計數法、液體分離培養法和液體培養計數法等，因此，它是微生物實驗、研究工作的基本方法之一，具體操作步驟如下：

（1）用無菌刀刮開底泥（或其他沉積物）樣品的表面，稱取中央的樣品10 克（或吸水樣10毫升），于火焰邊打開裝90毫升無菌海水（用于咸水樣品）或無菌水（用于淡水樣品）的錐形瓶棉塞，（瓶口于火焰上燒兒轉，立即放入樣品，塞好棉塞，振蕩混均，即沖稀10 倍，以下各步驟應始終在火焰邊操作。

（2）靜放1-2 分鐘后，棄沉淀物（即將上清液倒入另一無菌瓶）。

（3）左手拿錐形瓶，右手無名指，小指和手掌拔出棉塞，靠手腕動作，將瓶口在火焰上旋轉灼燒幾圈，以此滅菌．拇指、食指、中指抓無菌移液管在火焰上通過l-2 次，吸取經搖勻清液l 毫升（如果原樣品屬于水樣，吸后需吹回，反復數次，混勻后應立即再吸l 毫升）于9 毫升的無菌海水或無海水試管中。此管編號為2 ，再灼燒試管口或燒瓶口，塞緊棉塞，即稀釋100倍。

注意不能用容器口去迎棉塞。移液管插回原紙套卷中。

（4）取另一支無菌移液管，重復前個步驟．沖稀成10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸等倍，其濃度則為原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8

視樣品中所含的微生物數數量而決定沖稀倍數的多寡。一般可根據樣品含有機質的豐富程度及實驗目的作估計 ，若是近岸海水或輕度污染的港灣水、河口水，一般沖稀至10^-9-10^-7即可，而污染較嚴重的河口水或港灣水則須沖稀至10⁸倍以上，才能適含于水樣中的細菌稀釋計數。如果是應用于平板計數細菌．則沖稀至每個平皿培養基上長出30-300 個菌落為合適。