第二章水生微生物的分離與純化

    在海洋、湖泊、河流、池塘和飲用水中微生物都混雜地生長或生存著，要研究某一微生物，必須把它從混雜的微生物類群中分離出來，這種過程稱為“分離”。微生物學中把一個細胞通過分裂得到后代的過程叫做純化培養。微生物分離與純化的方法很多，可分為稀釋倒平板（平皿）法，劃線法單細胞挑取分離法和培養條件控制法等。后者包括．選擇培養基分離法。好氧與厭氧培養分離法和pH 、溫度等控制分離法。

    應用上述方法使細菌單個細胞或同一類細胞在培養基上長出菌落，而后根據菌落及菌體的形態特征挑取所需單個菌落的菌苔少許，接種于斜面培養基中培養，然后再從斜面培養基的菌苔挑出分離（或直接從單菌落中挑出），反復數次直到生長的菌落形態一致及其菌體形態也一致為止，則可提供生理生化鑒定、研究。

 

一、培養基的配制

 

（一）培養基配制的基本原理

      由于科學研究或生產需要，人工配制的適合于不同微生物生長、繁殖或積累代謝產物的營養基質及其生活環境叫培養基．各種微生物對營養的要求各不相同。盡管當前培養基配方多至數千種，但為進一步研究微生物和提高生產，特別是尋找或發現新種時，現有培養基配方不一定是最適用的，甚至是不適用的。譬如：目前尚未找出一種培養基能滿足海泥或海水樣品中所有的微生物生長的需要。因此，在學會配制培養基的同時應掌握關于培養基配方設計的基本原則。

 

1 ．選擇適宜的營養物質

 

( 1 ）碳源：它是構成微生物細胞及其代謝產物碳架的營養基質和提供能量的來源。碳源可分為有機和無機兩大類。培養自養微生物時、一般挑選無機碳化合物作為碳源，而培養異養微生物時則用有機碳，即碳水化合物，碳氫化合物等。

 

( 2 ）氮源：它是構成微生物細胞物質或代謝產物中氮素來源的基本營養物質，也可分為無機和有機氮源兩大類。主要是作為微生物細胞合成原生質和細胞其他結構的原料。一般不作能量的提供者。培養有固氮能力的固氮細菌，部分光合細菌和藍藻用分子氮．即氣態氮（空氣），培養酵母菌、霉菌，放線菌和許多腐生細菌及動植物的病原菌．多選用銨鹽或硝酸鹽作氮源，也可利用某些有機氮化合物為氮源。如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、魚粉、黃豆餅粉、玉米漿等。

 

( 3 ）無機鹽：其主要功能是構成細胞和酶組成部分，維持酶的活性．調節微生物細胞的滲透壓，氫離子濃度，氧化還原電位等，配制一般微生物培養基時采用硫酸鹽、磷酸鹽和含鉀，鈉、鎂、鐵、氮等元素的化合物．培養硫細菌時，應適當增加硫的用量。培養海洋微生物時，則要增加氯化鈉含量，或以陳海水代替蒸餾水等。

 

( 4 ）微量元素：如鉬、鋅、錳、鈷、鎳、銅、碘、溴、釩等。主要功能是作為酶蛋白成分之一，能活化酶。它們的存在與否，往往能非常強烈地影響微生物的生命活動。微生物對其需要量極微，在培養基中一般僅含0.1ppm就能滿足，多了反而會使微生物中毒。這些微量元素常常混在其他營養物質和水中，所以配制培養基時，通常不需另加效量元素。

 

( 5 ）生長素：包括維生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶三類物質，是維持微生物正常生活不可缺少的、需要量不大的特殊有機物。大多數維生素是輔酶的組成結構，嘌呤和嘧啶的主要功能是構成核酸和輔酶．很多異養微生物和所有自養微生物本身都能合成所需的生長素，均不必在其培養其中另加現成的生長素。缺陷型的變異菌株則需要在基本培養基中附加適量相應的生長素才能生長得好。常用作生長素的物質有酵母膏、玉米漿、肝浸液等。許多作為碳、氮源的天然成分，如麥芽汁，土豆汁，牛肉膏、麩皮、米糠等皆含有豐富的生長素，在含有此類物質的培養基中就無需加生長素。

 

( 6 ）水：微生物細胞內含有大量的水分（約75-85％）, 它既直接參加微生物的代謝過程，又是代謝反應的介質。水的比熱高，有利于調節微生物細胞的溫度。所以水在微生物細胞中的功能是多方面的。海水、自來水，河水等均可用于培養基的配制，但當水中的礦物質含量過多時必須經過軟化后才能采用．配制合成培養基時應采用蒸餾水或無離子水。培養海洋微生物或其稀釋液時需用陳海水。

 

( 7 ）凝固劑：有瓊脂（洋菜）、明膠（動物膠）及硅膠（水玻璃）等。制備固體或半固體培養基時皆需加入上述凝固劑中的一種。瓊脂性能穩定不被大多數微生物液化、分解、利用．對大多數微生物無害，不因滅菌而受破壞，40 ℃ 時凝固，96 ℃ 能完全熔化，透明度、粘度皆好，故制平板、斜面或半固體培養基時均使用它。而明膠的熔點低（25 ℃ ）, 能被多種微生物水解利用，故僅在鑒定微生物時使用它。硅膠與鹽酸及硫酸中和時凝成膠體，適用于分離自養微生物如硝化細菌，亞硝化細菌等。

 

2．確定各種營養物質的用量

在設計配制培養基方案中除選擇各種營養物質外，還必須確定所需營養物質的用量及其量的比例。這應根據所培養的微生物在整個代謝過程中的需要和培養目的而定，以適量為宜，既不妨礙微生物正常生長和培養的目的，又不致于造成浪費。培養基中水溶性的物質用量過多，濃度過高、滲透壓也就過高，則會阻礙微生物的吸收利用，并抑制其生長。微生物如將一份氮化合物作為自身細胞物質時．約需四份碳化合物作能源。因此一般來說，碳源的用量最大。氮的用量次之。碳氮用量之比，因微上物的種類而異，培養細菌和酵母菌的碳氮比約為5 : 1 ，霉菌約10:1 。一般碳源約占培養基的百分之幾，氮源占千分之幾．無機鹽中磷、鉀用量約為0.07%，鎂、硫約為0.02%，各種維生素用量稍大，每升中約合若干毫克。

 

3 ．調配和控制適宜的酸堿度

    各類微生物因其生理功能的差異，在其生長繁殖時所要求的酸堿度（pH 〕各不相同。通常培養細菌或放線菌時，pH須周至7.0-7.5，而酵母菌則需偏酸些，pH 應調在4.5-6.0之間。

    微生物在生長和代謝過程中能引起培養基酸堿度的變化，這往往抑制了微生物的繼續生長和代謝。故在制備培養基時得加適量緩沖液或不溶性碳酸鹽，借以維持適宜的pH范圍。當培養基中的酸堿度在6.4-7.2之間波動時可加入磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合組成的緩沖劑。若培養基中產生大量酸時，此磷酸緩沖劑不能維持恒定的pH，此時必須加入不溶性的碳酸鹽（如碳酸鈣），以中和微生物所產生的酸，產生的二氧化碳從培養基逸出，故阻止了培養基pH的降低。

為觀察培養過程中培養基的pH 值變化，常在培養基中加人適宜的指示劑，如表2-1 所示，

 

表2-1 常用指示劑及酸堿度（感應界）指示范圍

 

據表2-l ，如欲觀察培養基pH 在7.0左右變化，則可選用溴百里酚藍為宜，取此劑0.1 克。滴加0.1N的氫氧化鈉并研磨使之溶解，而后加水至250毫升。每10 毫升培養基中可加配好的指示劑0.5 毫升。

 

4 .針對工作目的選制不同形式培養基

培養基的種類很多，從不同角度可分幾大類。

 

（1）按對培養基組成物質的化學成分是否完全了解，可分成合成培養基、半合成培養基和天然培養基。用化學成分完全了解的各營養物質配成的培養基稱為合成培養基。在實驗室范圍，對微生物的營養、代謝、分類鑒定．生物測定．選育種和遺傳等方面的研究時，通常選配合成培養基．天然培養基是采用天然有機物。如蛋白胨，肉浸汁、酵母浸汁、牛奶、血清、土壤浸液等制成的培養基。

它具有經濟方便等優點，除實驗室采用外，生產上也常利用它。其缺點是它的化學成分不夠清楚，不夠穩定。

 

( 2 ）按物理狀態可把培養基分為固體培養基、半固體培養基和液體培養基三種：在生產上和生理代謝等基本理論研究上選用液體培養基。加1.5-2%瓊脂或5-12%明膠等凝固劑的液體培養基能凝固成固體狀態，稱之為固體培養基．在進行微生物分離．鑒定，計數、保藏時選配固體培養基．含有少量（0.2-0.5%）瓊脂的培養基稱半固體培養基，要觀察細菌運動特征、鑒定菌種、測定抗菌素噬菌體的效價滴定時均可采用它。

 

（3）按培養基的特殊用途：可將培養基分為增殖培養基、選擇培養基、鑒別培養基。

增殖（加富）培養基是根據所要培養或篩選的微生物的生理特征增加一定營養的培養基。如培養基中加入人血、血清、動物或植物組織提取液等等為加富培養基，用于培養要求比較苛刻的一些異養微生物．在水樣或泥樣中所需的菌種較少時，常選用增殖培養基．

 

選擇培養基是根據某種或一類微生物的特殊營養要求或時一些物理、化學因素敏感性較強而設計的。利用這種培養基可把所需的微生物從混雜的其他微生物中分離出來。

 

選擇性培養是據某些細菌對碳、氮源和其他營養物質的特殊要求而設計的。如以纖維素作唯一碳源的培養基可分離到分解纖維素的微生物；以含石蠟油為碳源的培養基可分離到利用石蠟油的微生物。用缺氮培養基可分離到固氮菌．用硫代硫酸鈉或硫黃末為基本營養源的培養基可從海泥、海水或土壤中分離出排硫桿菌、氧化硫桿菌或脫氮硫桿菌等．

 

另一種辦法是在培養基中加少量的對某些細菌有特殊抑制作用的染料或抗菌素．若于培養基中加低濃度（l ：100000 ) 的染料如結晶紫，亮綠、孔雀綠等制成的選擇培養基中，只有革蘭氏陰性細菌可生長，這方法可用于大腸桿菌的鑒別試驗，如加濃度約50單位／毫升的青酶素、鏈霉素、四環素，能抑制細菌和放線菌，而對霉菌和酵母菌卻無抑制作用。若加濃度為50-100 單位／毫升的鏈霉素于麥芽汁培養基中．可減少細菌生長從而分離出酵母菌。

 

鑒別培養基是加某種試劑或化學藥物于培養基中．使不易從菌落特征區別出來的微生物經這種培養后，由于它們的代謝產物對試劑或化學藥品反應不同，而呈現鮮明的差異，有助于快速鑒別某種微生物．如檢查淡水，海水和飲料中是否含有腸道致病菌時，常用伊紅美藍培養基區別大腸桿菌和產氣桿菌。當大腸桿菌發酵培養基中的乳糖時，使伊紅與美藍結合生成黑色化合物，長出的大腸桿菌菌落呈紫黑色，并帶金屬光澤，菌落較小，而產氣桿菌菌落較大，呈棕色。

 

配制鑒別培養基必須滿足以下三個條件；

① 培養基所含營養能保證所鑒定的細菌正常地生長：

② 培養基中包含有足夠數量的參與反應的物質，

③ 細菌在培養基中的代謝產物不干擾觀察結果。

 

特殊的天然培養基，如海洋積淡水中病毒、立克次氏體，一般培養在動植物體內或組織細胞中，而在普通培養基中不生長。現在已知100 多種病毒可自人的腸道或其他分泌物中排泄出來而污染水源．包括腸道病毒 ，如脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、甲型胃腸炎病毒等。這些病毒在自來水中可活2-168 天，海水中可活2-130 天．貝類生物體內如牡蠣體內可活90天。