1. 1.4 %PPLO瓊脂培養基
[用途]
分離支原體
[配法]
牛心(去脂絞碎)250g ,氯化鈉5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g,蛋白胨10g ,酵母浸膏1g ,瓊脂粉14g ,蒸餾水1L。
(1) 牛心消化液配制:取去脂絞碎牛心250g ,氯化鈉5g及蒸餾水900ml混合;另取胰蛋白酶2.5g,溶解于100ml 5g / L 氯化鈉溶液中,然后與上述牛心消化液混合,放置50-60 ℃ 水溫箱內消化2h ,中間不斷攪拌消化后用兩層紗布過濾,濾液煮沸5min ,用濾紙過濾后,補足水分至原量,然后加酵母浸膏1g ,混勻,冷卻后調pH 至8.0 ,分裝后121 ℃ 滅菌15min 備用。
(2) 支原體基礎瓊脂:取上述牛心消化液(已加氯化鈉)1L,加蛋白胨10g 和瓊脂粉14g ,混合后,加熱溶解調pH 至7.8-8.0,再加熱煮沸,用脫脂棉或絨布過濾,過濾后分裝于圓瓶中,每瓶70ml,121 ℃ 滅菌15min 備用
(3) 250g / L 鮮酵母液制備:食用鮮酵母塊250g ,加蒸餾水1L ,混合后,煮沸2min ,用濾紙過濾,濾后置4 ℃ 冰箱中過夜,使之沉淀,次日吸取上清液,用150g / L 氫氧化鈉溶液調pH 至8.0,再煮沸1 次,冷卻后,3000r/min 離心45min ,吸取上清液,分裝于瓶中,121 ℃ 滅菌15min ,放4 ℃ 冰箱中備用,可保存3 月。
(4) 傾注平板:溶解基礎瓊脂,冷卻至80 ℃ 左右,每瓶(70ml)內立即加預溫在37℃ 培養箱內的無菌馬血清或小牛血清20ml , 250g / L 鮮酵母浸出液10ml,10g / L 乙酸鉈溶液2.5ml ,青霉素G 鉀鹽溶液(20 萬U / ml )0.5ml 和兩性霉素B 溶液(5mg/ml)0.1ml;充分混勻后傾注9cm平板,經37℃ 培養過夜,無菌試驗陰性者,存放4 ℃ 冰箱備用
注:
(1)乙酸鉈是極毒藥品,須特別注意安全操作
(2) ??支原體美藍瓊脂平皿為分離肺炎支原體的選擇性平皿,口腔、唾液分泌物中的其它支原體均被抑制生長,肺炎支原體生長為“桑椹狀”無色的菌落
(3) 支原體傳代、移種用0.1 %半固體瓊脂,配制時除用0.1 %瓊脂粉外,其它成分與支原體基礎培養基相同,但不加兩性霉素,此半固體瓊脂分裝在試管內滅菌備用。傳代時將平皿上已選定的支原體菌落用無菌刀片切下一小塊,直接移種于半固體管中,置適當的氣體環境中,培養3-5 天后,可在瓊脂小塊出現“小島狀”絮片生長物,或呈顆粒狀,即次代支原體
(4) 支原體傳代用液體培養基:其成分與上述支原體半固體瓊脂相同,不加瓊脂粉和兩性霉素B 。
2 肺炎支原體分離用雙相培養基
[用途]
用于喉拭標本直接分離肺炎支原體
[配法]
(1)底層瓊脂斜面:其成分與上述支原體半固體瓊脂相同,不加兩性霉素B 。無菌分裝于經滅菌的鏈霉素空瓶中,每瓶3ml,置成斜面,此為底層
(2) 液體培養基:其成分與上述支原體傳代用液體培養基相同。但在未高壓滅菌前,再加入葡萄糖1g ,美藍0.001g (即10g / L 美藍溶液0.lml), 1g / L 酚紅溶液2ml , 115 ℃ 滅菌15min ,冷卻后,再加入輔助成分和防止雜菌生長的成分。然后,在上述底層瓊脂斜面上,每瓶再加入液體培養基3-5ml,瓶塞用煮沸滅菌的后口橡皮塞經37℃ 培養過夜,無菌試驗陰性者,存放4 ℃ 冰箱中備用,可保存1 月
注:已接種的雙相培養管,培養37℃ 普通環境2-4 周,觀察結果,陽性生長見雙相管由淡紫色變成綠色再轉變為黃色,因肺炎支原體發酵葡萄糖,還原美藍。取陽性管用分離支原體固體平皿分離菌落,平血放入含95 %氮氣和5 %二氧化碳環境中,或放入含5%二氧化碳環境中培養2-4 周,陽性平皿可見菌落生長
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