植原體是一類無細胞壁的原核微生物，能侵染包括農作物、林木、花卉、雜草等植物，給農、林業生產帶來巨大損失，近年來，此類病害在某些重要植物處于蔓延和加重的趨勢。這類微生物尚不能在人工培養基上離體培養，其細胞結構、與寄主植物的互作等方面也有其明顯不同特點，研究制定此類微生物的保藏技術規程，對于植原體菌種資源的規范和安全保藏、科學研究及合理利用具有重要意義。

 

 

1   范圍

本規程規定了植原體菌種保藏的基本原則、方法及技術要求。

本規程適用于各類植原體菌種的保藏。

2   術語與定義

2.1植原體  phytoplasma

指寄生于植物韌皮部和介體昆蟲體內的、具有三層單位膜結構的無細胞壁的原核生物。一般引起植物葉片黃化和發育畸形等癥狀。

2.2植物組織培養  plant tissue culture

在無菌的條件下，將離體的植物器官和組織在人工控制的環境下培養，使其再生形成完整植株的過程。培養植原體—植物共生體即是培養已感染植原體病菌的植物外植體。

 

3   原理

植原體菌種尚不能在離體人工培養基上培養。被感染的寄主植物攜帶植原體，因而通過對植物莖段的繁殖，即可達到對所攜帶植原體的繁殖和培養。植物組織培養和營養繁殖，使植原體所受的選擇壓力較低，較低的溫度條件可大大減緩植物和所感染植原體的代謝活動，從而減少菌株突變，降低繁殖速度，有效保持菌種原有性狀。

4技術要求

4.1   保藏方法

用組織培養法保藏感染植原體的植物組織，于5-25 C溫度范圍內保藏。

4.2植物組織培養基

選用適于植物組織正常生長的培養基，不含四環素簇抗生素或其它對植原體生長和繁殖有抑制作用的成分。

4.3   培養溫度和光照

培養溫度20-28 ℃為宜

光照強度在1000-3000  lx，光期為10-14h/d

4.4   保藏溫度和時間

常溫保藏（20-28 ℃），保藏時間1-3個月

低溫保藏（6-10 ℃），保藏時間6個月至1年。

注：保藏溫度低于4 ℃會凍傷植物組織材料而導致植原體死亡。

4.5   保藏期檢測

定期檢查保藏菌種的房間、冷庫、冰箱的溫度、濕度。

檢查各保藏試管有無雜菌污染現象，如發現雜菌污染，則取出該管重新移植，培養后補缺。

4.6移植復核

大量植原體-植物共生體進行移植時，各菌株的編號、所用培養基需仔細核對無誤。每次移植培養后，對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄，核實無誤再行存放。

4.7     保藏指標

當獲得的組培苗表現典型癥狀或在熒光顯微鏡下觀察到特異植原體 DNA 熒光后即可進行菌株的保藏。

5     操作方法與步驟

5.1   帶菌外植體采集

在田間采集表現典型癥狀的新鮮枝條，剪去葉和嫩稍，經酒精和升汞等消毒劑表面消毒后，截成具節莖段，移入培養基上培養。

5.2   無雜菌組培苗的獲得

外植體長出新枝后，選無雜菌感染的外植體，截取新枝，移入新配制的培養基上培養和繁殖。如培養基被雜菌污染，將組培苗再進行表面消毒處理，移入新的培養基上培養，重復操作2-3次，直至獲得無雜菌組培苗為止。

5.3    組織帶菌鑒定

用DAPI熒光顯微鏡技術和PCR技術鑒定組織帶菌狀況和濃度。

DAPI熒光顯微鏡技術步驟：取植物幼莖、葉柄或根等，進行組織切片，厚度在100mm左右，用5％戊二醛固定2小時左右，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.0）洗滌后，用1mg  /ml  4'6－二瞇基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，最后置于落射熒光顯微鏡下檢查韌皮部特異性植原體DNA熒光，激發濾光片波長為365nm,阻斷濾光片波長為420nm。

PCR技術步驟：從組織中提取植物和植原體總DNA，用植原體16S  rRNA等基因序列的引物進行PCR基因擴增，然后進行瓊脂糖電泳，檢測特異性擴增產物譜帶。

5.4  常溫保藏

植原體-植物共生體在適宜的組織培養基上培養，并正常溫度和光照下（20-28 C，光照強度在1000-3000  lx）進行保藏，保藏周期為1-3個月。

5.5   低溫保藏

將正常溫度和光照下（20-28 C，光照強度在1000-3000  lx）培養的植原體-植物共生體移入含組織培養基的試管內，移入6-10 C低溫冷藏柜內保藏，1-2個月將試管暴露于正常培養溫度和光照條件下補光2-3天，然后存放于低溫冷藏柜繼續保藏，保藏周期為6個月至1年以上。