大型真菌是菌物中的一個重要類群，很多種類具有較高的營養價值和藥用價值，是目前菌物中最有開發應用前景的一類；此外，一些大型真菌能夠分解枯死植物，對維持自然界物質循環、生態平衡有重要的作用，可開發應用于造紙業和環境凈化；一些大型真菌能引起樹木病害或損害多種木質產品，對此類病原真菌的認識的加強，有利于預防和減少危害的發生。大型真菌的規范性保藏對于微生物菌種資源的安全、高效保藏及共享具有重意義。

       制訂科學、適用的大型真菌菌種保藏技術規程對長期有效保藏遺傳資源、異地保藏生物多樣性具有重要的價值和意義。

 

1 范圍

本規程規定了大型真菌菌種保藏的基本原則、方法及技術要求。

本規程適用于各類大型真菌菌種的保藏。

2 術語與定義

2.1大型真菌  macrofungi

大型真菌是菌物中形成大型子實體的一類真菌，泛指廣義上的蘑菇或蕈菌。

2.2程控降溫 controlled rate freezing

2.3液氮超低溫保藏  preservation in liquid nitrogen

液氮超低溫保藏技術是將菌種在-196℃的液態氮，或在-150℃的氣態氮中長期保藏的方法，其原理是利用生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

3 原理

菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營養等手段，以達到最大限度地降低菌種的代謝強度，抑制菌絲的生長和繁殖，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態，從而延長菌種的保藏時間。

4技術要求

4.1 不同菌種應根據要求選擇適合的培養基進行培養。

4.2 接種須無菌操作，避免雜菌污染。

4.3 定期檢查

保藏期間要定期檢查保藏菌種的冰箱溫度和濕度；檢查保藏器皿的棉塞有無生霉現象，如發現異常則立即取出該管重新純化，經培養后補上空缺；在低倍解剖鏡下抽樣檢查有無螨蟲等害蟲，發現時須及時消除。

5 方法與步驟

5.1 斜面低溫保藏法

將要保藏的菌種接種在斜面培養基上，20℃－30℃培養，當菌絲長滿斜面時取出，置于 4℃冰箱或冰柜中保藏，每隔 3-6 個月轉接 1 次，具體間隔時間應根據菌種特性確定。

5.1.1 保藏設備和材料

4℃冰箱、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養箱、酒精燈、三角瓶、接種針、試管、培養皿、漏斗、燒杯、吸管、瓊脂粉等等。

5.1.2 斜面的制備

5.1.2.1 器皿的準備

在斜面制備的過程中要用到的一些玻璃器皿，如試管、培養皿、三角瓶、漏斗等，使用前洗凈，并于80℃烘干備用。

5.1.2.2 培養基的制備

在燒杯中倒入500ml水，按配方稱取材料，依次加入水中，逐個溶解，最后定容至1L(在加料過程中，先加緩沖化合物，然后是主要元素、微量元素，最后加維生素等)。冷卻至室溫，調pH值。然后將瓊脂粉加入煮沸的液體培養基中，不斷攪拌至融化為止，最后補足蒸發的水分。

5.1.2.3 分裝

將配好的固體培養基趁熱進行分裝，裝入試管中的培養基不宜超過試管高度的四分之一。在分裝過程中，應注意勿使培養基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

5.1.2.4 滅菌與擺放斜面

將包扎好的培養基滅菌（0.1MPa,30min）。滅菌完畢后擺放斜面時，斜面長度不得超過試管管長的一半。

5.1.2.5 無菌檢查

將制備好的斜面放入30℃培養箱中培養3天做無菌檢查。

 

5.1.3 接種

在超凈工作臺上，用無菌接種針挑取菌絲體連同少量培養基，接種于適宜的無菌新鮮培養基斜面上，在管壁或小瓶外壁上分別貼好標簽標明菌株編號（或名稱），然后置于適宜溫度的培養箱中培養。

5.1.4 培養

培養4-30天后，根據菌落的形態和其它培養特征，判斷新培養物是否為原菌種，并注意有無雜菌污染現象。檢查無誤后，進行保藏。

5.1.5 低溫保藏

培養好的斜面于 4℃－6℃保藏，相對濕度，通常在 50%－70%以下。

5.1.6 保藏時間

一般 3－6 個月。

5.1.7 菌種的轉接

將斜面培養物轉接到適宜的新鮮斜面上，在適宜的培養條件下進行培養。

5.1.8 菌種的復壯

如果發現菌種有退化現象，應將退化的菌種引入原來的生活環境中使其生長和繁殖，然后再進行純種分離，例如在宿主體內生長等方法進行復壯。

5.1.9 斜面低溫保藏法應注意事項

——每次轉接時，應仔細核對各菌株的編號、所用培養基等，發現錯誤立即糾正。

——每次轉接培養后，應對照原保藏的菌株和菌種順序號卡片名錄，檢查其培養特征，核實無誤后，再行存放。

——斜面低溫保藏的菌種，一般每個菌株應保藏相繼的三代培養物，以便對照。

5.2 液氮超低溫保藏法

5.2.1 保藏設備和材料

液氮罐、程控降溫儀、超凈工作臺、高壓消毒器、菌種培養箱、酒精燈、培養皿、打孔器、安瓿管（圓底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管），10%甘油或 5%或 10%的二甲基亞砜、馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉等。

5.2.2 安瓿管的清洗和消毒

安瓿管（2 ml）使用前先用自來水沖洗，再用蒸餾水漂洗，于80℃烘箱烘干。將標簽放入安瓿管上部，滅菌(0.103MPa,30min)，備用。

5.2.3 保護劑的配制和滅菌

一 般 常 用 甘 油 或 二 甲 基 亞 砜 作 保 護 劑 。 將 甘 油 配 成 10% 的 溶 液 ， 滅 菌 (0.1MPa,30min)，備用；或二甲基亞砜配成5%或10%的溶液，過濾滅菌，備用。

5.2.4 菌種的準備

將菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂或綜合馬鈴薯培養基平板上，20℃－28℃下培養，待菌絲長滿后，用無菌打孔器從平板上切取大小均勻的小塊（直徑約 5-10mm），轉入安瓿管中；或在安瓿管中加 1.2-2ml 的瓊脂培養基，接種，培養 2-10 天。最后加 1.5ml保護劑，封口。

5.2.5 凍結

一般冷凍速度控制在以每分鐘下降 1℃為好，使樣品凍結到-35℃。

目前常用的有三種控溫方法

——程控降溫法：應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控制降溫速率。

——分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，先將安瓿管或塑料小管置于-20℃至-40℃冰箱中 1-2 小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降 1-1.5℃。

——對耐低溫的微生物、可以直接放入氣態或液態氮中。

5.2.6 保藏

在氣相中-150℃，液相中-196℃。

5.2.7 保藏時間

一般10年以上。

5.2.8 轉接方法

從液氮罐中取出安瓿管，立即放入 38℃-40℃溫水中，快速復蘇。為了防止污染，用 75%酒精洗安瓿管表面，待表面干燥后，用已消毒過的剪刀在安瓿管一端敲開或開啟塑料小管，將內容物移至適宜的培養基上，并置于適宜溫度的培養箱中進行培養。

5.2.9 液氮保藏應注意事項

——防止凍傷，操作注意安全，戴面罩及皮手套；

——安瓿管要用圓底的。若用塑料管一定要擰緊管蓋；

——運送液氮時一定要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮；

——注意存放液氮容器的室內通風，防止過量氮氣使人窒息；

——當從液氮容器取出安瓿管時，要特別小心，防止破裂爆炸；

——注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期填充液氮。