實驗目的

熟悉單胞菌的形態特征及培養特點，魚類病原菌分離鑒定的基本方法，鞏固單胞菌所致魚病的基本特性及癥狀。

實驗材料

單胞菌株純培養物 普通瓊脂平板 鮮血瓊脂平板 普通肉湯 無菌蒸餾水 解剖刀 剪刀 鑷子 紗布 白瓷盤 潔凈的玻片 平皿 光學顯微鏡 一次性注射器 針頭 記號筆 酒精棉球 餌料 玻璃注射器 水族箱 氣泵 控溫儀 吸管 洗耳球 滅菌試管 實驗用鯽魚 生理鹽水 溫度計 撈網

實驗操作程序

1 ．單胞菌株的純培養

[ 培養基 ]

（ 1 ）普通肉湯培養基： 按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏），置于鋁鍋或搪瓷缸中。

牛肉膏 5g 磷酸氫二鉀 1g

蛋白胨 10g 蒸餾水 1000ml

氯化鈉 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6

初配好的培養基呈酸性故要用 NaOH 調整。將 pH 測定后的肉湯培養基用濾紙過濾，將過濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。

（ 2 ）普通營養瓊脂培養基

普通肉湯 1000ml

瓊脂 20g

??瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類物質，對病原性細菌無營養作用，但在水中加溫可融化，冷卻后可凝固。在液體培養基中加入瓊脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培養基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％則成半固體培養基。

??將稱好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將 pH 調至 7 . 4 ～ 7 . 6 。瓊脂融化過程中需不斷攪拌，并控制火力，不使培養基溢出或燒焦，并注意補充蒸發掉的水份。

加熱溶解好的培養基可用濾紙??進行過濾，固體培養基要用 4 層紗布趁熱過濾（切勿使培養基凝固在紗布上），之后按實驗要求，將配制好的培養基分裝入試管或三角瓶中，包扎好待滅菌，將培養基置于高壓蒸汽鍋內， 121 ℃ 滅菌 15 ～ 30min ，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即成普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成高層瓊脂。

?鹽水瓶中的普通瓊脂已手掌感觸，若將瓶緊握手中覺得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度（ 50 ～ 60 ℃ ），每只滅菌培養皿倒入約 15 ～ 20ml ，將皿蓋蓋上，并將培養皿于桌面上輕輕回轉，使培養基平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。

培養基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應過濾除菌，再按規定的量加入培養基中。
（ 3 ）鮮血瓊脂培養基

?將滅菌的普通瓊脂培養基冷卻至 50 ℃ 左右，加入無菌的綿羊或家兔脫纖鮮血達 5 ％（即每 100 ml 普通瓊脂加入鮮血 5 ～ 6 ml ），混合后，分裝滅菌試管立即擺成斜面或傾注于平皿內（如果瓊脂溫度過高，鮮血加入后則成紫褐色，溫度過低，則鮮血加入瓊脂易凝不易混合。注意，混合時切勿產生氣泡）待凝固后，置 37℃ 培養 24h ，無菌檢驗合格方可應用。

??無菌血液是用無菌操作方法采自健康動物，通常是綿羊或家兔的血液，加到盛有 5 ％滅菌枸櫞酸鈉或 3 ％滅菌肝素的 100 ml 三角瓶內，或加到盛有玻璃小珠的滅菌三角瓶內搖動脫纖后置冰箱中待用。

[ 細菌培養 ]

?取實驗斜面或平板上的單胞菌株，于普通平板或鮮血平板上分區劃線，以得單菌落，觀察普通平板和鮮血平板上細菌的生長表現，觀察的主要內容有：

??（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：針尖大，直徑小于 0 . 5mm ，如支原體菌落、豬丹毒桿菌菌落；小菌落：直徑在 0 . 5 ～ 1 mm 之間，如嗜血桿菌、布氏桿菌菌落；中等大小的菌落：直徑在 1 ～ 3 mm 之間，如巴氏桿菌、沙門氏桿菌菌落；大的菌落：直徑大于 3mm ，如炭疽芽孢桿菌菌落等。

（ 2 ）形態：圓形，不規則形（根狀、樹葉狀）

（ 3 ）邊緣：整齊，不整齊（鋸齒狀、蟲蝕狀、卷發狀）

（ 4 ）表面：光滑、粘液狀、粗糙、荷包蛋狀、漩渦狀、顆粒狀

（ 5 ）隆起度：隆起，輕度隆起，中央隆起，平升狀、扁平狀，臍狀（凹陷狀）

（ 6 ）顏色：無色、灰白色、白色、金黃色、紅色、粉紅色

（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明

（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血

??挑單菌落接種于普通瓊脂平板 28 ℃ ， 24 h 培養或接種于盛肉湯的三角燒瓶中， 150 rpm ， 28℃ ， 18 － 24 h 振蕩培養。注意觀察培養物的渾濁度（輕度渾濁、中度渾濁、渾濁）、沉淀物的性狀（顆粒狀、絮狀、粘稠狀）、培養基表面是否形成菌膜、菌環以及培養物的顏色等。

2 ．菌液稀釋

三角燒瓶中的液體培養物用生理鹽水直接倍比稀釋至適當的濃度，平板上的細菌用涂布棒刮下并用生理鹽水沖洗掉，稀釋到一定濃度，并用紫外分光光度計或麥氏比濁管法檢測（事先可確定一條比色濃度與細菌含量之間的關系曲線）。

3 ．細菌接種

??試驗魚人工感染的接種方法目前最常用的有浸泡、口服、注射、涂抹等，究竟選用哪一種方法最合適，需要根據不同的疾病類型和可能的侵入途徑而定。如體表的病，可采用浸泡法：是體內的病，可采用口服、注射等。接種動物的細菌用量是個問題。接種量過大，即使該菌為非病原菌，可能會因大量菌體裂解釋放的大量內毒素致死動物，并無細菌繁殖致病的過程。問題的關鍵是要測定所分離的細菌對接種動物的半數致死量（ LD 50 ），根據 LD 50 的大小來判斷其致病力的強弱，進而判斷其是否為病原菌。這也適用于區分同種細菌不同菌株致病力的差異。一般的接種劑量為 50LD 50 。

??本實驗采用注射的方法。實驗魚在實驗前需進行 1 ～ 2 周的暫養。每組實驗用鯽魚 10 尾，每尾肌肉或腹腔接種 0 . 1 ～ 0 . 5ml 稀釋后的肉湯培養物，置盛有水的水族箱內，用控溫儀使溫度維持在 28 ～ 30 ℃ 左右。定時投餌和換水，同時設接種無菌生理鹽水的對照組。

4 ．觀察記錄

觀察接毒鯽魚的發病癥狀及死亡情況，并做好記錄。

5 ．細菌分離

對瀕臨死亡或剛死不久的鯽魚進行病原菌的分離。

魚體表： ?取病灶部分小片或用接種環刮取病灶部位，接種于普通肉湯培養基增菌或直接在普通瓊脂平板（鮮血）上劃線分離。

內部組織器官： ?用 70 ％酒精浸過的紗布覆蓋體表或用酒精棉球擦拭，進行體表消毒，無菌打開病魚的腹腔，以肝、腸、心臟等臟器為材料，用剪刀在火焰上燒灼滅菌，再在組織上燙之，殺死表面的雜菌，隨即在燒灼部刺一小孔。用滅菌的接種環（待冷 2 ～ 5 秒），伸向燒灼部小洞中，用手指將接種環輕輕旋轉兩次，借以達到取足材料的目的。左手持握普通（鮮血）瓊脂平板（平皿蓋留在桌上），使之盡量垂直，以免空氣中雜菌落入，并靠近火焰，右手持帶有細菌材料的接種環在窮漢字平板上分區劃線。劃線時接種環面與平板表面成 30 ～ 40 度的角輕輕接觸，在平板表面輕快地移動，接種環不應嵌入培養基內，且不要重復，否則形成菌苔。劃線完畢，蓋上皿蓋，接種環滅菌后放下，并在平皿底部用記號筆注明接種材料、日期及操作者代號。也可對實質性臟器用無菌剪刀下一小塊，用鑷子夾住病科使其剖面接觸潔凈的玻片，作多個觸片，染色后在顯微鏡下直接鏡檢，能快速獲得結果。

鰓部： 用無菌接種環刮取鰓上的分泌物劃平板。

血液及體液： 用無菌注射器吸取病魚血液和體液，滴于平板涂布或劃線及肉湯內，分離細菌。

實驗操作步驟

（一）致病菌的培養和實驗前的準備工作

1 ．實驗魚的馴養

1 ）實驗材料：養魚的塑料箱，異育銀鯽，控溫加溫棒，充氣泵，氣管，氣頭，溫度表

?2 ）實驗方法：實驗用的健康異育銀鯽，在加網罩的塑料箱中馴養約一個星期，充氣增氧，在馴養期間水溫逐漸升高，每天溫度升高 2 ～ 4℃ ，最終保持在 28 ～ 30℃ 左右。及時吸污和換水，保持水質清新。

2 ．致病菌（嗜水氣單胞菌）的擴大培養

1 ）實驗材料：營養瓊脂培養基斜面（每組 2 支），接種環（ 1 支），嗜水氣單胞菌斜面菌種（ 1 支）。

2 ）實驗方法：按微生物學實驗方法把菌種接種到營養瓊脂培養基斜面上，放在 28℃ 培養箱中培養 24h 小時候備用。

3 ．營養瓊脂培養基平板

1 ）實驗材料：滅菌空培養皿（每組 4 只）， 250ml 三角燒瓶（每組 2 只）， 100ml 量筒（ 1 只），天平（ 1 臺），營養瓊脂培養基，稱量紙，攪拌玻璃棒。

2 ）實驗方法：稱取 4.1 克 營養瓊脂培養基，倒入三角燒瓶中，加入用量筒??量取的 100ml 蒸餾水，用玻璃棒攪拌稀釋后，用棉塞塞住三角燒瓶，待滅菌，滅菌后溫度下降至 40 ～ 50℃ 時倒平板。

4 ．致病菌感染和分離時所用器械滅菌

??1 ）實驗材料：剪刀（每組 3 把），鑷子（每組 3 把），注射器（每組 3 只），針頭（每組 5 只），滴管（每組 3 個），鋁盒（每組 1 個）。

2 ）實驗方法：洗凈所有的器械裝入鋁盒中滅菌，備用。

（二）致病菌的人工感染

??1) 實驗材料：嗜水氣單胞菌斜面（每組 2 支），試管架（ 1 個）酒精棉球（ 1 瓶），無菌生理鹽水，滅菌空試管，麥氏比濁管。

2 ）實驗方法：用裝有針頭的注射器（或無菌吸管??），吸取無菌生理鹽水，滴注到培養有嗜水氣單胞菌的斜面上，振蕩使斜面上的菌落洗下（或用滅菌接種環輕輕刮下），倒入滅菌空試管中，用無菌生理鹽水稀釋調節菌濃度，與麥氏比濁管進行比色，使菌濃度達到 2.1×10 9 個細菌 /ml （ 21 億），用滅菌注射器抽取菌懸液，待人工感染時用。注射部位在魚的背鰭前端與側線之間的中部區域。用酒精棉球在注射部位擦拭進行體表消毒后進行肌肉注射。針尖斜向魚的頭部，與魚體成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾魚注射量為 0.6 ml ，每天觀察魚的發病及癥狀等情況并做好記錄。

（三）致病菌分離

??1 ．實驗材料：滅菌的剪刀（每組 3 把），鑷子（每組 3 把），解剖刀，接種環，營養瓊脂培養基平板（ 4 只）。

??2 ．實驗方法：將具有癥狀的活魚或剛死的魚，放在瓷盤中，用擰干的酒精棉球在病魚體表進行消毒，用剪刀從靠近肛門的地方向上剪開再沿側線向前剪開，至鰓腔后緣，向下剪至胸鰭基部。用無菌鑷子揭開腹壁，暴露腹腔。解剖刀上的刀片在火焰上燒灼后，迅速壓印在魚的肝（或腎）表面滅菌，再用燒灼后的接種環在肝（或腎）地滅菌處插入臟器內，旋轉 1 ～ 2 圈后抽出，在營養瓊脂平板上進行劃線分離，作好標記（時間、臟器名稱），放在 28℃ 培養箱中培養 24 h 后觀察菌落形態特征，在占比例高的菌落形態一致的菌落中挑選一個菌落，用接種環挑起接種到斜面，作為致病菌株的候選對象。（分離出的菌株再進行人工感染，觀察是否發病及病癥是否與該病病魚癥狀一致，如一致，分離的該菌株為致病菌，再次人工感染實驗省略）。

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