3.3%鹽酸酒精;
染色的第一步是制作涂片。菌液涂片時,用接種環沾取菌液點在載玻片上,標本可直接在玻片上涂布。菌落涂片時,先取生理鹽水 1滴,置玻片上,用接種針挑取菌落,在鹽水中涂布。涂片時必須注意應輕輕操作。猛烈的動作會改變菌細胞原有的排列形式,或造成細菌鞭毛脫落,影響結果的準確性。制備的涂片應自然干燥,并經火焰固定,固定溫度不宜過高,以玻片背面接觸手背不燙為準,否則可能使細胞形態改變。將固定后的涂片進行染色。
一、革蘭染色
本染色是最基本的染色法,可用于標本涂片或菌落涂片。染色結果將細菌分為革蘭陽性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。
試劑
1. 結晶紫溶液
A液: 結晶紫 2g
95%乙醇 20ml
B液: 草酸銨 0.8g
蒸餾水 80ml
需在用前24h將A液、B液混合,過濾后裝入試劑瓶內備用。
2.碘液
碘 1g
碘化鉀 2g
蒸餾水 300ml
碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升水,使其逐漸溶解,然后研磨,繼續加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補足水量。
也可用少量蒸餾水,先將碘化鉀完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。
3.脫色液:95%乙醇。
4.復染液
A. 貯存液: 沙黃 2.5g
95%乙醇 100ml
B. 應用液: A液 10ml
蒸餾水 90ml
染色方法:
1.涂片經火焰固定,加結晶紫液染1 min,清水沖去染液。
2.加碘液染l min,水洗。
3.加脫色液,不時搖動約10~30s,至無紫色脫落為止,水洗。
4.加復染液,染30s,水洗。
5.干后鏡檢。
二、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰標本時,可以適當增加標本涂片的厚度,以提高檢出率。染厚涂片時,須掌握復染色時間。如果背景過深,影響鏡檢。
奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性,取培養菌落涂片染色時,呈現兩種現象,視野中有些菌細胞陽性,另外一些則陰性;有時同一個菌體上,紅色的深淺亦有不同,觀察時應予注意。
抗酸染色有兩種常用方法:① 堿性復紅法又稱萋納(Ziehl—Neelsen)法。 ② 熒光染料金胺O法(也稱金胺O-羅丹明B法)。
(一) 堿性復紅染色法
試 劑
1.萋納石炭酸復紅溶液
堿性復紅乙醇飽和溶液 10ml
5%石炭酸溶液 90ml
2.脫色劑 *
濃鹽酸 3ml
95%乙醇 97ml
3.復染液(呂弗勒美藍液)
美藍乙醇飽和溶液 30ml
10%氫氧化鉀 0.1ml
蒸餾水 100ml
染色方法
1.涂片經火焰固定,加石炭酸復紅溶液,徐徐加熱至有蒸汽出現,切不可沸騰。染5 min(若染色奴卡菌需要加長時間),水洗。
2.加脫色劑,不時搖動玻片至無紅色脫落為止,水洗。
3.加復染液,染0.5~l min,