位置
空氣通過前面開口進入生物安全柜的速度大約為0.45 m/s。這樣速度的定向氣流是極易受到干擾的，包括人員走近生物安全柜所形成的氣流、打開窗戶、送風系統調整以及開關門等都可能造成影響。因此，最為理想的是，生物安全柜應位于遠離人員活動、物品流動以及可能會擾亂氣流的地方。在安全柜的后方以及每一個側面要盡可能留有30 cm的空間，以利于對安全柜的維護。在安全柜的上面應留有30～35 cm的空間，以便準確測量空氣通過排風過濾器的速度，并便于排風過濾器的更換。
操作者
生物安全柜如果使用不當，其防護作用就可能大大受到影響。操作者在移動雙臂進出安全柜時，需要小心維持前面開口處氣流的完整性，雙臂應該垂直地緩慢進出前面的開口。手和雙臂伸入到生物安全柜中等待大約一分鐘，以使安全柜調整完畢并且讓里面的空氣“掃過”手和雙臂的表面以后，才可以開始對物品進行處理。要在開始實驗之前將所有必需的物品置于安全柜內，以盡可能減少雙臂進出前面開口的次數。
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