經富集培養以后的樣品，目的微生物得到增殖，占了優勢，其他種類的微生物在數量上相對減少，但并未死亡。富集后的培養液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優勢的一類微生物中，也并非純種。例如同樣一群以油脂為碳源的脂肪酶產生菌，有的是細菌，有的是霉菌，有的是芽孢桿菌，有的不產芽孢，有的生產能力強，有的生產能力弱等等。因此，經過富集培養后的樣品，也需要進一步通過分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來。

一、好氣微生物的分離

分離的方法很多，大體可分為兩類：一類較為粗放，只能達到“菌落純”，如稀釋涂布法，劃線分離法，組織分離法等。前兩種方法由于操作簡便有效，工業生產中應用較多。組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株。另一類是較細的單細胞或單孢子分離方法，可達到“菌株純”或“細胞純”的水平。這類方法需采用專門的儀器設備，復雜的如顯微操作裝置，簡單的可利用培養皿或凹玻片作分離小室進行分離。下面對這幾種分離純化方法分別加以介紹。

（一）稀釋涂布法

把土壤樣品以十倍的級差，用無菌水進行稀釋，取一定量的某一稀釋度的懸浮液，涂抹于分離培養基的平板上，經過培養，長出單個菌落，挑取需要的菌落移到斜面培養基上培養。土壤樣品的稀釋程度，要看樣品中的含菌數多少，一般有機質含量高的菜園土等，樣品中含菌量大，稀釋倍數高些，反之稀釋倍數低些。采用該方法，在平板培養基上得到單菌落的機會較大，特別適合于分離易蔓延的微生物。

（二）劃線分離法

用接種環取部分樣品或菌體，在事先已準備好的培養基平板上劃線，當單個菌落長出后，將菌落移入斜面培養基上，培養后備用。該分離方法操作簡便、快捷，效果較好。

在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下，微生物的純種分離方法可以簡化如下：第一種方法，取一支盛有3～5ml無菌水的粗試管或小三角瓶，取混勻的樣品少許（0.5g左右）放入其中，充分振蕩分散，用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養，或者用接種環接一環于平板上劃線培養。這種方法不需要菌落計數，比以上常規稀釋法簡便。第二種方法，取風干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養基平板上或混入培養基中制成平板，置適溫培養一定時間，長出菌落。例如分離小單孢菌就可采用該方法，從河泥中取樣，風干研碎，取樣品粉末20～50mg直接加到天門冬酰胺培養基中，混合均勻制成平板，培養后長出魚卵狀菌落。這種方法有時分離不夠充分，可用劃線法進一步純化。