3.1 技術概覽

AdEasyTM系統是由T.C.He等（1998）構建的用來代替傳統腺病毒重組系統的一個快捷系統。在這個系統中，只需二步即可產生重組腺病毒：先將表達盒裝入轉移載體，然后再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是：1）腺病毒DNA是大型的線性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點；2）基因組過大（36kb），難于操作。在AdEasyTM載體系統中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質粒，而不是線性DNA，同源重組則在大腸桿菌進行。相對于傳統系統而言，這二點改進使病毒DNA操作更容易，同時由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。在本系統中，首先將基因cDNA插入一個轉移載體，將得到的質粒用PmeI線性化，然后在大腸桿菌BJ5183中與病毒DNA質粒pAdEasy-1進行同源重組。pAdEasy-1缺失了E1和E3區，其E1區功能將在293A細胞中得到互補。重組子通過卡那霉素篩選，用內切酶進行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PmeI線性化，暴露其反向末端重復序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），轉染QBI-293A細胞后產生重組病毒顆粒。  同源重組在線性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質粒之間進行。應用完整的腺病毒質粒而不用內切酶進行線性化，對于產生重組腺病毒至關重要。轉移載體中的卡那霉素抗性基因則可用來篩選重組子。由于線性化的轉移載體產生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此此同源重組系統有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183有recA活性，但同時缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重組能力。一旦重組子經確定，則可轉入普通的無recA、endA活性的細菌株如DH5α等進行擴增。由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重組。