三、朊病毒�ァ　‰貌《臼莵啿《局杏忠活愔匾�感染因子，侵害動物與人類。因其主要由蛋白質構成，迄今尚無含有核酸的確切證據，故暫定名為朊病毒(Virino)或蛋白侵染子(Prion)。 由于對各種朊病毒的本質的了解不夠，采用“因子”命名，例如癢疫因子和牛海綿狀腦病因子等，似乎較為恰當。�ァ�

1.病原性概述�ァ　≡谥参锷希�新的類病毒正在被不斷發現，但在動物中，卻從未發現過類病毒及其引起的疾病。然而人和動物存在著一類被稱為亞急性海綿樣腦病的中樞神經系統疾病，包括人的庫路病(Kuru)、克�惭攀喜�(Creutzfeldt�睯akob disease)、 阿耳茨海默病(Alzheimer disease)、格�彩肥暇C合癥(Gerstmann�睸traussler syndrome)、羊的癢疫(Scrapie)、水貂傳染性腦病(Transmissible mink encephalopathy)、黑尾鹿和糜鹿的慢性消耗病(Chronic wasting disease of mule deer and elk)以及牛海綿狀腦病(Bovine spongiform encephalpopathy)。這些疾病具有一些共同的特性：

(1)潛伏期長，一般為幾個月、幾年甚至十幾年以上；

(2)機體感染后不發熱，不出現炎癥癥狀，也不發生特異性免疫應答反應；

(3)臨床上出現進行性共濟失調、震顫、癡呆和行為障礙等神經癥狀；

(4)病程緩慢進行，但均終于死亡；(5)病理剖檢變化以腦灰質的海綿樣變為特征。 �ァ�

(1) 庫路病：又稱震顫病，是1966年確定的第一種人類亞急性海綿樣腦病。發生于巴布新幾內亞Eastern Highland省局限范圍內的一個稱為Fore的部落中。患者首先出現共濟失調和震顫等小腦癥狀，隨后癱瘓死亡。病理學變化主要表現為嚴重的神經原變性和喪失、膠質增生和灰質海綿樣變。這種病是由于該部落人有吃死人腦和死人肉的習俗而傳播的。隨著這一習俗的廢除，庫路病已經得到有效控制。�ァ�

　(2) 克�惭攀喜。杭碈�睯病，又稱傳染性早老癡呆，最早發現于1920年，但到60年代后期才被確定為是由非典型病毒引起的中樞神經系統傳染病。歐美克�惭攀喜〉陌l病率約百萬分之一，似有一定的家族性。我國1986年才有首例尸檢報告，某些醫院的神經科病房中也已有了可疑患者。患者肌陣攣，共濟失調，嗜眠，出現進行性癡呆。病灶變化與庫路病相似。應用人源或動物源的生物制劑可能是克�惭攀喜�傳播的一個重要途徑。20多年前，美國應用人源垂體激素治療垂體功能缺陷患者，由于原料(尸體腦垂體)中可能混有克�惭攀喜』颊叩哪X垂體，從而使接受治療的患者遭受了感染。從1982年以來，在注射過這種制劑的患者中成批地出現了克�惭攀喜　１静∷坪踹�與吃食污染有癢疫因子的羊肉，特別是羊腦有一定關系。來自以色列的一個統計，發現喜食羊腦的利比亞猶太人和南非猶太人，其克�惭攀喜〉陌l病率比不吃羊腦的歐洲猶太人高30倍。但是另一些移居以色列的地中海人和北非人也同樣喜食綿羊的上述組織，克�惭攀喜〉陌l病率并不增高。��   克�惭攀喜〉陌l病年齡平均為65歲，很少發生于青年人，但最近英國發現的10個病例 ， 平均年齡只27��5歲，甚至有幾個十幾歲的少年。有人推測可能出現了一種新型的克�惭攀� 病。��

　　(3) 阿耳茨海默病和格�彩肥喜。菏侨祟惲硗獾膬煞N亞急性海綿樣腦病。前者具有與老年性癡呆相似的病理學變化，可能是克�惭攀喜×硪慌R床�膊±硇汀８癃彩肥喜∈怯勺髠冉腔夭≡钏�致的左右失認、計算不能和右側偏盲癥。��

　　(4) 癢疫：是綿羊和山羊中樞神經系統的一種慢性進行性疾病，又稱癢病或搔癢癥。早在18世紀中葉就發生于英格蘭，隨后傳播至歐洲許多國家。二十世紀30～40年代報道于北美，蔓延至世界許多地區。我國于1983年從英國進口的羊群中發現疑似病例，組織學檢查符合癢疫特征。潛伏期長達1～5年，于發病早期，病羊易驚，頭高舉，行走時高高舉步；頭、頸或肋腹部發生震顫；用手抓搔時常可使其發生咬唇反射。多數病例出現搔癢癥狀，病羊體溫正常，且照常采食，但日漸消瘦；運動失調，后肢更為明顯，病羊不能跳躍，常反復跌倒，最后完全不能站立和走動。病期為幾周至幾個月， 幾乎100％死亡。尸體肉眼病變不明顯， 病理組織學上的突出變化是中樞神經系統的海綿樣變性，大量神經元發生空泡化，特別是在紋狀體、間腦、腦干和小腦皮層最為明顯。神經元胞漿內含有許多空泡，形成所謂的“泡沫細胞”。癢疫具有比較明顯的家族史傾向，某些品種的綿羊如英國Suffolk品種，比另一些品種的綿羊易感。 病羊全身組織中均含有病原體，經腦內、皮下、腹腔和肌肉內接種途徑，也易使小鼠、大鼠、倉鼠以及水貂和猴等實驗動物感染，一般經4～8個月的潛伏期后發病，出現類似于自然病例的中樞神經系統癥狀，病情逐漸增進，并終于死亡。病綿羊與易感山羊接觸，可將癢疫傳給山羊，出現癢疫癥狀，人工感染的小鼠與健鼠接觸，也可使后者感染發病。感染母羊對胎兒的垂直傳播途徑早已被肯定。�ァ�

　(5) 水貂傳染性腦病：是成年貂的一種類似癢疫的疾病。病理學特征也是慢性進行性腦海綿樣變性。潛伏期8～18個月以上。病貂在臨床上首先表現為高度易驚， 繼而奮力啃咬，運動失調，最后嗜眠和昏迷而死。病貂腦組織內含毒量極高，腦內、肌肉接種或經口喂服都可使敏感貂感染發病，也可實驗感染綿羊、山羊、倉鼠和猴等動物。有人認為，水貂不是本病的自然宿主，而是因吃食癢疫病羊的肉或臟器等而遭致感染的，但是流行病學調查證明，本病更可能因水貂之間的互咬而傳播。�ァ�

　(6) 鹿慢性消耗病：1978年，美國Colorado的黑尾鹿群中發現一種慢性消耗性疾病。其臨床癥狀和神經系統的病理變化，與羊的癢疫極為相似。人工接種健康黑尾鹿亦已成功。后來(1982)又在附近的麝鹿中發現這樣的疾病。�ァ�

　(7) 牛海綿狀腦病：1985年南英格蘭的牛群中發現一種海綿樣腦病，俗稱瘋牛病，至19 95年5月，英國飼養的約15萬頭牛感染或可能感染了本病。初步認為是牛吃食了病牛或污染癢疫的肉骨 粉而發生的。本病現已發現于歐洲多數國家，加拿大、阿曼和蘇丹等也從英國進口的牛中發 現了本病。潛伏期2��5～8年。病牛易驚，對聲音和觸摸反應過敏，行動異常，運動失調， 起 站后后肢叉開，步樣蹣跚。晚期不能站立，并因衰竭而死亡。病程1～3個月。病變以中樞神 經系統灰質部形成海綿狀空泡為特征，發病牛的年齡為3～11歲，但多見于3～5歲的成年牛 。 迄今尚無牛→牛或羊→牛間傳播的確切證據。應用病牛腦接種小鼠，可以使其感染發病 。��    1994年2月以來，英國發現12例克�惭攀匣颊�(包括最近發生的2例)，并已死亡8人。據 英國海綿狀腦病咨詢委員會的調查、分析，認為這些病例同1989年禁止食用特定牛內臟之前同瘋牛病接觸有關。�ァ　�1988年7月英國禁止用反芻動物源蛋白飼料喂牛，1995年計劃屠殺和燒毀400萬頭牛。 許多國家，包括我國，亦已開始禁止從英國進口牛肉和牛肉產品。�ァ　「鶕�現有的一些證據，在人和動物的這些疾病之間存在著密切的聯系。有人甚至武斷地認為，克�惭攀喜『退�貂傳染性腦病等可能都來源于癢疫，將克�惭攀喜』颊呋虬W疫病羊的腦組織接種山羊，都可使其發生在臨床和神經病理學上與自然癢疫相似的實驗感染。將癢疫因子感染水貂，則引起與水貂傳染性腦病無異的疾病。如上述，牛海綿狀腦病主要是因吃食污染癢疫骨粉所致。

 

　　朊病毒除可在表中所述的實驗宿主體內增殖傳代外，癢疫因子已成功地在小鼠神經細胞瘤細胞系內增殖，并已傳代。

2.特性與本質�ァ　∮捎诎W疫因子易于人工感染小鼠和倉鼠，并能順利傳代，因此關于朊病毒特性和本質的研究，大多來自癢疫因子。�ァ　“W疫因子對理化學因素具有異常的抵抗力，其對紫外線照射的抵抗力比常規病毒(即真病毒)高40～200倍，比馬鈴薯紡綞形塊莖病類病毒高10倍， 其對離子照射的抵抗力，亦明顯高于常規病毒。對化學滅活劑的抵抗力也高，3��7％甲醛溶液處理4小時，不能使其完全滅活。對非離子型去污劑，例如NP40和去氧膽酸鈉等具有極大抵抗力。核酸酶不起滅活作用。羥膠和二價陽性鋅離子也不起化學修飾作用。但是1M氫氧化鈉、0��5％次氯酸鈉以及1％十二烷基硫酸鈉加2�矌�基乙醇卻可使其滅活或大致滅活。蛋白酶K是蛋白質中很少有能抵抗的蛋白酶，但是應用溫和性去污劑由感染腦乳劑中抽提純化的癢疫因子卻對其具有極高的抵抗力。以凝膠電泳、蔗糖梯度密度法或強力去污劑提取的癢疫因子，可在長時期的蛋白酶K作用下滅活。人們認為，這是由于癢疫因子蛋白易于 集聚或不溶于去污劑中的緣故。�ァ　∮捎谄�今沒有證明癢疫因子中存在核酸，DNA酶和RNA酶等不呈現核酸酶滅活作用，癢疫因子又對許多理化學因素呈現很高的抵抗力，因此人們推測癢疫因子可能只是一種蛋白質，或者核酸極小，且被很好地包藏于蛋白內部，從而得以抵抗上述物理學照射和化學劑的滅活作用。�ァ　�Prusiner等采取癢疫因子感染的倉鼠腦組織，應用Triton X��100/去氧膽酸鹽抽提、聚乙二醇沉淀、核酸酶和蛋白酶消化、膽酸鹽/十二烷基肌氨酸鈉抽提、硫酸胺沉淀、Triton X��100/十二烷基硫酸鈉抽提、在連續蔗糖梯度中沉淀、蛋白酶K處理、十二烷基硫酸鈉抽提以及高效液相柱層析等一系列提純手段，分離獲得一種特殊的糖蛋白，分子量為27 000～30 000kDa，稱為PrP，即蛋白酶抗性蛋白(proteinase resistant protein )。PrP在一定條件下形成桿狀結構或纖維狀結構。后者就是可在電鏡下看到的所謂癢疫相關纖維(SAF, scrapie associated fibrils)。SAF發現于自然感染和人工感染癢疫的綿羊腦組織內，而且也見于克�惭攀喜　⒏癃彩肥喜『蛶炻凡』颊咭约芭：＞d狀腦病的腦組織內。SAF寬4～6nm，長50～500nm。因其具有特異性，故可作為癢疫類疾病的病理學診斷指標。但也有人認為SAF只是一種感染產物，而不是感染因子本身。 那末SAF與PrP的關系如何? 學者們認為，PrP是SAF的主要組成部分，因為應用蛋白印跡技術(westernblot)可以發現SAF中含有PrP，抗PrP抗體能夠修飾不同毒株來源的SAF。SAF似乎是與細胞膜相關的PrP所組成，在用去污劑抽提時，PrP以SAF的形式出現。 根據蛋白印跡分析結果，最近發現未感染動物細胞膜成分中存在著與PrP具有相同抗原決定簇的正常成分。但是這種正常細胞成分因對蛋白酶K敏感而可與PrP相區別。因此，制備SAF標本或提純PrP，應該應用蛋白酶K消化手段，以期除去對蛋白酶K敏感的許多組織蛋白。��

由于PrP的氨基酸序列已被部分測出，約250個左右的氨基酸，所以有可能構建寡核苷酸 探針和cDNA文庫。 令人深感興趣的是，從正常動物組織中很易測到PrP mRNA。 隨后發現PrP基因是一個單拷 貝基因，具有2個外顯子和1個很大的內含子，在正常和不正常(癢疫相關)的PrP基因或mRNA之間似乎沒有差別。因此， 癢疫相關PrP是由大多數細胞均有的一個正常內源性基因編碼的。正常腦組織和癢疫腦組織中這種蛋白的差異表現在PrP本身的理化學性質上。 在正常腦組織中的去污劑抽提物中，PrP不能聚集成大分子的纖維樣結構，且對蛋白酶K高度敏感。相反，癢疫感染腦中的PrP聚集成電鏡下可見的大分子纖維樣結構，且在溫和性去污劑溶液中對蛋白酶K具有抵抗力。但將SAF溶于十二烷基硫酸鈉等強去污劑中，則將分解成為33～35kDa的多肽，且可被蛋白酶K所完全消化。�ァ　∪绫緯�第四章所述，正常動物腦組織提取物中存在著PrP的異構體，分子量為33 000～35 000，稱為PrP����33～35c��。PrP����33～35c��在組成上與癢疫因子PrP����27～30 ��的前體PrP����33～35��，即PrP����33～35sc��相同。兩者的主要區別在于對蛋白酶K的 敏感性： PrP����33～35c�獙Φ鞍酌窴敏感，而PrP����33～35sc�獙Φ鞍酌窴具有較高抵抗力。�ァ　「鶕�以上研究結果，特別是一些新的發現，學者們對癢疫因子的本質提出了諸多解釋，歸納起來主要有“唯蛋白論”和“核蛋白論”兩種說法。前者認為，癢疫因子沒有核酸，只是正常宿主PrP�琧蛋白的修飾形式；后者認為，既然癢疫因子存在許多不同的毒株，呈現不同的表型，那就證明必然有核酸作為其組成成分。1991年Weissman提出了統一這兩種假設的所謂聯合學說。按照這一學說，癢疫因子感染組織的粗提物中的感染因子，即“完全朊病毒”(holoprion)，由兩個成分組成，其中一個成分是PrP���﹕c��， 即使沒有核酸，PrP���﹕c��也能致發疾病；另一個成分是核酸，可能存在許多變型，并因修飾P rP�瑂�琧的生化特性而決定后者的株特異性，這種核酸可能正常地連結于PrP���﹕c��上，  但也存 在于未感染的宿主細胞中。沒有核酸的PrP���﹕c��侵入細胞后，可能激活某個細胞核酸， 使 其呈現朊病毒核酸的作用。朊病毒核酸借助正常細胞酶(聚合酶)而復制，這一過程由PrP�瑂 �� c所激發，甚至可能依賴PrP���﹕c��的存在。因此，PrP���﹕c��是致病成分，但其原始結 構由宿主基因所編碼，而朊病毒核酸則是傳播性遺傳成分。�ァ　�無論是完全朊病毒或PrP���﹕c��，在侵入敏感細胞后，均可發生增殖過程，

3.發病機理�ァ　×馨途W狀內皮系統可能在癢疫的發病機理中起著重要作用。以感染羊腦組織接種小鼠，最早可在脾臟、外周淋巴結、胸腺、腸管和唾液腺中檢測到癢疫因子，腦和脊髓是最后感染的器官。但是最近報道，在經一定階段的潛伏期后，感染因子集中存在于中樞神經系統。經皮下、腹腔或靜脈等外周途徑感染后，脾臟是癢疫因子復制的最初部位，至少在嚙齒類是這樣。切除脾臟可以延長潛伏期，但不能阻止癢疫的發生，說明其他臟器，如內臟淋巴結等也可作為癢疫因子增殖的原發部位。在脾臟中增殖后，癢疫因子沿內臟自主神經軸索內途徑到達中樞神經系統，最初限于胸部脊髓，隨后向頭側和尾側方向擴展。也不排除血源性散布的可能性，因在癢疫和克�惭攀喜�實驗感染的小鼠和倉鼠體內，均在血液和血清中發現感染因子。實驗感染山羊體內感染因子的分布與小鼠相似，但時間較長。�ァ　【C合以上實驗研究結果，經口途徑發生的自然感染，始發部位可能是咽淋巴組織，隨后再向淋巴�簿W狀組織擴散，或者最初感染發生在遠端小腸和近端結腸，隨后再向脾臟和內臟淋巴組織擴散。�ァ　“W疫等朊病毒感染導致神經原纖維束、淀粉樣原纖維、癢疫相關原纖維(SAF) 和淀粉樣斑等的形成。這些病理產物在化學和免疫學上與神經元中的一種10nm神經絲相關。由于朊病毒干擾這種神經絲的產生，導致神經絲在核周體內堆積以及神經元溶解，或者啟動不正常神經絲的產生，導致淀粉樣原纖維和淀粉樣斑的形成。�ァ　≡缙谘芯堪l現小鼠基因能夠影響癢疫的潛伏期。后來證明一個特殊基因sinc對潛伏期具有明顯影響。最近發現編碼PrP的基因緊密聯鎖于影響潛伏期的一個prn�瞚基因。prn�瞚基因可能就是上述sinc基因。迄今尚未完全闡明prn�瞚或sinc基因本身是否就是PrP的結構基因，或者只是位于這一結構基因近傍的一個基因。主要組織相容性復合物(MHC)的H��2位點也可影響癢疫的潛伏期，但并不與sinc或prn�瞚基因聯鎖。

4.診斷�ァ　∮捎诎W疫等朊病毒感染不誘發動物機體產生免疫反應，故在臨床發病以前，很難檢出感染動物。但是潛伏感染和臨床前期的感染動物卻是擴散疫病的重要傳染源。因此，為了減少動物之間的傳播，必須建立有效的診斷方法，以期盡早發現和淘汰感染動物。　　由于沒有血清學診斷方法，現在進行診斷的主要根據是臨床癥狀(持久的疾病經過、臨床發病動物幾近100％的死亡率以及各該疾病的特殊癥狀，如癢疫的搔癢等)、病理組織學變化(腦的海綿狀變性和神經元空泡化等)以及生物學試驗。�ァ　』疾�動物丘腦、中腦和腦干內含有高濃度的感染因子，將這些組織的乳劑腦內接種小鼠，可在13～20個月內使其發病，并可再以小鼠材料進行傳代，潛伏期縮短至5～7個月，甚至4～5個月。�ァ　�1988年，Satoshi等以相當于癢疫朊病毒蛋白N�捕艘粋�區域的人工合成多肽， 制備抗血清，采用蛋白免疫印跡技術，不僅成功地檢出了癢疫感染小鼠腦組織中的少量癢疫相關纖維(SAF)蛋白，而且也可在脾臟和淋巴結標本中檢出這種蛋白。 小鼠在腹腔接種癢疫因子4周后，脾臟標本就可呈現陽性反應，從而為臨床前期的感染動物的檢出提供了一個可能手段。這一方法的缺點是被檢標本的制備技術比較復雜，感染組織經乳化、凍融和超聲處理后，還需經過DNA酶、去污劑和蛋白酶K以及超速離心沉淀等操作， 才能取樣作電泳和蛋白免疫印跡測定。�ァ　�1991年，Ikegami應用兔抗綿羊PrP多克隆抗體，通過蛋白免疫印跡技術，在已呈現癢疫癥狀的6頭自然感染綿羊的中樞神經系統、脾臟和淋巴結標本中，分別在5頭、 4頭和3頭檢出了PrP。對47頭臨床健康綿羊也作了PrP的檢出試驗，結果在39頭被檢綿羊中，從3頭的脾臟和淋巴結中檢出了PrP。�ァ　「鶕�上述結果，應用抗PrP抗體進行蛋白印跡試驗， 有可能成為檢出臨床前期感染動物的一種方法。但是必須指出，被檢標本必須應用蛋白酶K處理，以免出現因健康動物細胞膜成分中正常存在的PrP類似物，導致假陽性反應。��Prusiner等應用以SDS-PAGE提純的倉鼠PrP����27－30��制備兔抗血清，據云在蛋白印跡和免疫斑點檢測中表現良好的特異性。�ァ�

5.控制�ァ　∑�今尚無預防朊病毒感染的疫苗。一般采取屠殺發病動物以及與發病動物有接觸史的動物，控制本病的進一步流行，銷毀尸體。制訂育種計劃時，不僅要淘汰產生患病后代的公羊和母羊，而且淘汰其所有后代。加強海關檢疫，嚴禁從疫情發生地區引進種畜。　　培育對癢疫等朊病毒感染具有抵抗力的動物品種，可能是防制此類疫病的有效途徑。��