6. 冷凍干燥保藏法

（1）準備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管，大小要求外徑6-7.5mm，長105mm，球部直徑9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm²>，121.3℃滅菌30分鐘，備用。

??（2）準備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達數年至十數年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在最適培養基中用最適溫度培養，使培養出良好的培養物。細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期，若用對數生長期的菌種進行保藏，其存活率反而降低。一般，細菌要求24-48小時的培養物；酵母需培養3天；形成孢子的微生物則宜保存孢子；放線菌與絲狀真菌則培養7-10天。

?（3）制備菌懸液與分裝以細菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml.

（4）冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰（固體CO₂）酒精液或干冰丙酮液，溫度可達-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4~5分鐘，即可使懸液結冰。

?（5）真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結狀態，需準備冷凍槽，槽內放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內。

??抽氣一般若在30分鐘內能達到93.3Pa（0.7mmHg）真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續抽氣，幾小時內，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度26.7Pa（0.2mmHg），保持壓力6~8小時即可。

?（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管繼續抽氣，約10分鐘即可達到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空狀態下，以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。

??此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一，對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用，即使對一些很難保存的致病菌，如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存。適用于菌種長期保存，一般可保存數年至十余年，但設備和操作都比較復雜。

上一篇：保藏菌種的方法—4

下一篇：土壤中微生物分離純化培養