6.1 樣品的存放與制備如為冷凍樣品應于2℃~5℃解凍，且不超于18h，若不能及時檢驗，應置于-15℃保存，非冷凍的易腐樣品應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置于4℃冰箱保存，在24h之內檢驗。
無菌取樣品25g（ml）放入滅菌均質杯或均質袋中加225mLPBZE增菌液中，充分均質。
6.2 增菌培養
FB1增菌液225ML放30℃±1℃培養25h±1h吸收1ml加入10mlFB2增菌液中放30℃±1℃二次增菌25h±1h.
6.3 VIDA8快速篩選
取FB2增菌液，可按儀器生產廠的說明采取VIDA8快速篩選法進行快速篩選檢測，75min可獲初步結果。對于篩選為陰性的結果可直接按8.2報告來檢出單核細胞李斯特氏菌。對于篩選為陽性的結果按照6.4和6.9的條款進行分離培養和鑒定。
6.4 分離培養
6.4.1 選擇性培養基的分離培養
取增菌液一杯，劃線分離于選擇性培養基OXA、PALCAM瓊脂平板上30℃±1℃培養24h~48h
6.4.2黑色菌落觀察
李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長24h后菌落呈現黑色，直徑為4mm，在其周圍形成一個黑色環，培養48h，菌落仍呈黑色，直徑2mm~3mm，除在菌落周圍有一環外，在菌落中心部位的深層也形成黑點。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在OXA瓊脂平板上的菌落相似。
在OXA瓊脂平板和PALCAM瓊脂平板上挑選5個或更多可疑菌落，接種于TSA-YE瓊脂平板上，純培養后進行鑒定。
6.5 鑒定
6.5.1 藍色菌落鑒定
用45°斜射光照射TSA-YE瓊脂平板，菌落呈現藍灰色到藍色，用標準菌株作為陽性對照，將純化后的菌落接種于TSB-YE肉湯，30℃培養24h，供生化等項目檢驗使用。
6.5.2 類型運動鏡檢
挑選在TSA-YE瓊脂平板上生長良好的菌落于潔凈載玻片上，用0.8%生理鹽水制成懸浮液，壓上蓋玻片，于顯微鏡下觀察，李斯特氏菌為短棒狀桿菌，可見輕微的旋轉翻滾。用標準菌株作為對照。
6.5.3 革蘭氏染色
按照GB/T4789，38-2003進行革蘭氏染色李斯特氏菌顯短桿狀革蘭氏陽性反應。
6.5.4 過氧化氨酶實驗
挑取TSA-YE平板上的菌落于潔凈載玻片上，滴加1滴3%過氧化氫（H2O2）溶液，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應。
6.5.5 溶血實驗
將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20個~25個小格，每格刺種一個菌落，從每個TSA-YE瓊脂平板上至少挑取2個菌落刺種血平板，并刺種陽性對照菌（單核細胞增生李斯特氏菌利綿羊李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），30℃培養24h~48h，穿刺應剛剛透過瓊脂層，盡量避免接觸平板底部時太猛烈和和使瓊脂破裂，于明亮處進行觀察，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點周圍產生窄小的透明β型溶血環，綿羊李斯特氏菌產生大的β型溶血環，其他李斯特氏菌種不產生溶血環，
6.5.6動力試驗
將TSB-YE肉湯培養物穿刺接種于SIM半固體培養基，于室溫（20℃～25℃）培養48h,李斯特氏菌有動力，在半固體試管內呈典型傘狀生長。
6.5.7硝酸鹽還原試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種與硝酸鹽肉湯中，于35℃培養5d,加入0.2ml試劑A，再加入0.2ml試劑B,輕搖混合，如在1min～2min內出現紅色，判斷為陽性反應，如果沒有顏色顯現，在含有試劑A和試劑B的試管內再加入少量鋅粉，（約20mg）放置1h,如出現紅色，表示仍有硝酸鹽存在，未被細菌還原，判斷為陰性。
6.5.8 MR-VP試驗
將TSB-YE肉湯培養物接種與MR-VP肉湯中，于35℃培養48h，移取1ml培養物于潔凈試管中，加5%α-萘酚溶液0.3ml，在加4%氫氧化鉀溶液0.2ml，輕輕搖動試管約1min，靜置約20min，出現紅色為VP陽性反應，將剩余培養液繼續與35℃培養48h，加甲基紅指示劑1滴于試管中，出現紅色為MR陽性反應，李斯特氏菌均為MR-VP陽性反應。
6.5.9 三糖鐵試驗
用TSB-YE肉湯培養物接種于三糖鐵瓊脂（TSI）,于35℃培養5d，李斯特氏菌在斜面和底層產酸，不產硫化氫   
   

 

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