5 樣品處理
5.1 鬃、毛、絨、生骨粒
5.1.1 根據樣品多少將適當數量的同批樣品(最多不超過 10份)合編為一個檢驗樣品單位,作好記錄。
5.1.2 從合編為一個檢驗樣品單位的每個樣品袋中各取 1～2g樣品,一起放入一個適當大小的滅菌三角燒瓶中。
5.1.3 加樣品量 30～40倍(W/V)的預冷洗樣液于三角燒瓶,用滅菌膠塞將瓶口塞嚴。
5.1.4 將三角燒瓶放入冰水浴或 0～4℃冰箱內,間或搖動約 1h。
5.1.5 將瓶中洗樣液倒入 500mL滅菌離心管內,蓋住管口,以3000r/min離心20min。
5.1.6 棄去上清液(注意防止污染),加少許滅菌水,使沉淀均勻懸浮。
5.1.7 將離心管靜置 5～10min,待雜質下沉后,將上懸液移入另一支滅菌試管內,于65℃恒溫水浴加熱 30 min。
5.1.8 加洗樣液后的樣品于熱處理前如不能及時檢驗,應貯于0～4℃冰箱內,以防芽胞發芽。
5.2 動物毛皮如不立即檢驗,將棉拭子放于0～4℃冰箱內。
6 檢驗方法
6.1 分離培養
6.1.1 鬃、毛、絨、生骨粒
6.1.1.1 根據每管所包括樣品份數之多少,各接種 1～3個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接種時,用滅菌吸管吸取樣液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有剩余樣品,可增接數個平板,直至將樣品接種完。
6.1.1.2 用滅菌 L形玻璃棒將滴加的樣液涂布均勻。如樣液較多,可將平板置于36±1℃溫箱,微開皿蓋,使樣液迅速干燥。
6.1.1.3 翻轉平皿,置于36±1℃恒溫箱,培養 24～48h。
6.1.2 動物毛皮
6.1.2.1 將棉拭子由試管內取出,各涂抹一個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。6.1.2.2 翻轉平皿,置于36± 1℃恒溫箱,培養 24～48 h。
6.2 菌落及菌形觀察
6.2.1 將培養的平板取出,用肉眼,必要時借助放大鏡觀察有無典型炭疽桿菌菌落。炭疽桿菌菌落扁平、暗灰色、不透明、無光澤、表面粗糙、邊緣不整齊。用放大鏡觀察,邊緣呈卷發狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。
6.2.2 從典型或可疑菌落取培養物制備涂膜,經革蘭氏染色,鏡檢。炭疽桿菌被染成藍紫色,由多個菌縱連成長鏈。少數單個菌呈大桿狀,兩端平齊。有的菌體中央可見卵圓形不著色的芽胞。芽胞不使菌體膨大。
6.3 肉湯培養特性觀察取菌落和菌形均似炭疽桿菌的培養物,接種肉湯管,于 36±1℃恒溫箱培養 5～12h,觀察細菌生長情況。炭疽桿菌在肉湯中生長初期的特征是：肉湯上部澄清,無菌膜,下部有絮狀沉淀,沉淀不易搖散。
6.4 確定試驗
6.4.1 大豆凝集素吸收試驗
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀釋液(A11)一滴于比色板或載玻片上。
b. 用接種環取一滿環可疑菌落,研混于大豆凝集素稀釋液內成濃厚菌液,持續攪拌2～3min。
c. 加一滴 5％兔血球懸液,攪勻,前后傾動玻片 3～5min,觀察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
＋＋＋＋：血球凝集成塊狀,均勻散布,液體無色。
＋＋＋：血球凝集成大顆粒,均勻散布,液體無色。
＋＋：血球凝集成顆粒,均勻散布,液體無色。
＋：血球凝集成細小顆粒,均勻散布,液體無色。
±：血球凝集成細微顆粒,均勻散布,液體呈不顯著黃紅色。
－：血球不凝集,搖動后匯集于中央,呈淡黃紅色,液體呈不顯著黃紅色。
注：“＋＋＋”～“＋”為陽性。“±”為可疑。“－”為陰性。
6.4.2 噬菌體裂解試驗
6.4.2.1 方法
a. 用營養瓊脂平板的皿底外面畫三個直徑約 30mm ,相隔約 20mm為圓圈。
b. 用接種環取可疑炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物涂滿與兩個圓圈相對應的瓊脂表面。另取已知炭疽桿菌的新鮮肉湯培養物,涂滿與第三個圓圈相對應的瓊脂表面,作上區分的標記。
c. 待菌液被吸干后,在接種被檢菌的圓圈內,一個加一滴無菌肉湯,另一個加一滴炭疽桿菌噬菌體。在接種已知炭疽桿菌的圓圈內,加一滴炭疽桿菌噬菌體。
d. 將平皿放入36±1℃ 恒溫箱(隔架面要平,以防噬菌體液流散),微開皿蓋,使液體迅速干燥。然后翻轉平皿,培養12～18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌體的兩個圓圈內都出現蝕斑,加肉湯的圓圈內無蝕斑,為陽性反應。
b. 加已知炭疽桿菌的圓圈內出現蝕斑,加被檢菌的兩個圓圈內無蝕斑,為陰性反應。
c. 三個圓圈內都無蝕斑,表明噬菌體已失效,應另換有效噬菌體進行試驗。
6.4.3 串珠試驗
6.4.3.1 方法
a. 取適量 4～12h可疑炭疽桿菌肉湯培養物,接種于 1.8mL肉湯管內(制備濕片在低倍顯微鏡下檢查,每個視野應含菌鏈 5～10條)。
b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最終濃度為 0.5IU/mL 。
C. 于 37℃水浴培養 1～2h ,取出,加入 20％ 福爾馬林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 制備濕片,在顯微鏡下檢查。
6.4.3. 判定
＋＋＋＋：菌體大而圓,均勻,排列整齊；
＋＋＋：菌體圓,均勻,排列整齊；
＋＋：菌體橢圓,排列整齊；
＋：菌體均勻腫大,變粗；
±：菌體大小不一,不圓,排列不整齊；
－：菌體形態無變化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”為陽性。“±”為可疑。“－”為陰性。6.4.4 動物試驗6.4.4.1 取可疑炭疽桿菌的肉湯培養物,用生理鹽水稀釋為 10 000個菌/mL(微混濁),接種 2～3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL；其余每只于腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1～3d內),立即進行剖檢,觀察有無炭疽病理變化(如皮下膠樣水腫,脾臟腫大,血凝不良),制備數張血液和腹水涂片,供做菌形檢查,同時取病變材料或體液接種數管肉湯,以備核查。
6.4.5 染色鏡檢
6.4.5.1 染色液的配制
A液：美藍 0.3g乙醇(95％) 30.0mL
B液：0.01％氫氧化鉀溶液 100mL將 A、B兩液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 將被檢材料的涂片浸入固定液內 15～20 min；
b. 滴加染色液浸沒涂膜,染色 1～2 min；
c. 用水沖去染色液,自然干燥或用吸墨紙吸干水分；
d. 鏡檢。
6.4.5.3 判定炭疽菌菌體呈藍色,粗大桿狀,兩端平齊,相連成短鏈或成對,菌體周圍以淡藍紫色莢膜。   
   

 

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