3、病毒的接種及檢測 
  病毒常存在的部位有：鼻、咽、氣管分泌物、糞便、組織器官、體液、腦脊液、血液。常用對病毒敏感的動物或細胞作為病毒分離的材料。拭子一般在取樣后放入2ml加抗生素的肉湯中折斷、涮洗，低溫保存。用前將拭子中液體擠出，然后1500r/min離心15—20min，吸上清接種于細胞中。糞便標本一般用10倍Hanks液稀釋，振蕩使之乳化后2500r/離心15min，過濾后4℃1000r/min離心1h，取上清1.8ml，加入0.2ml抗生素4℃作用1h后接種細胞。蟲媒蚊一般捕獲后喂養5%葡萄糖水3d，待血食消化后，凍死。每50只為一批加入2—3ml5%酒精一生理鹽水，4℃作用1h后用Hanks液洗3次，用無菌研磨器磨碎后加入Hanks液4℃1000r/min離心1h，取上清以備接種用。 
    細胞成片后，棄去生長液，Hanks液洗一次，接種上述處理后標本，加維持液使之能覆蓋細胞，在培養溫度下吸附1h后棄去，加維持液每日觀察病變。 
    在組織培養中病毒的識別方法主要有細胞病變、蝕斑測定、紅細胞吸附、干擾現象、中和試驗、免疫熒光、細胞代謝改變、電鏡觀察等。 
（1）細胞病變：多數病毒在細胞內增殖，可引起細胞形態學改變，稱為細胞病變效應。常見病變為細胞變圓、融合、壞死、溶解、脫落。有的病變表現為細胞變圓，堆積成葡萄狀，如腺病毒；有的則表現為細胞融合，形成多核巨細胞，如麻疹病毒；有的細胞內出現包含體，如狂犬病病毒。 
    細胞病變的判斷標準可根據出現病變的細胞在整個單層中所 占面積的比例進行判定。采用標準如下： 
+ 表示開始出現病變至少有25%細胞發生病變； 
++表示有25%—50%的細胞發生病變； 
+++表示有50%—75%的細胞發生病變； 
++++表示有75%—100%的細胞發生病變。 
   判定時必須對整個細胞單層進行全面的觀察，然后加以判定。不能只看幾個視野。因有些病毒感染可引起特殊的細胞病變，所以根據病毒所引起 的病變特點可進行初步推斷，縮小鑒定范圍。 
（2）蝕斑測定：這是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養瓶中，病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養瓊脂，使病毒在單層細胞培養中有限擴散。結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶 。用活性染料（如中性紅）染色。則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑。每一個蝕斑是 由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位（PFU）。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU/ml表示。         
（3）紅細胞吸附：流感病毒和副流感病毒感染的細胞膜上出現病毒基因編碼的抗原，可以與紅細胞結合。若向培養瓶內加入紅細胞，可見紅細胞吸附于細胞膜上，這種現象稱為紅細胞吸附現象。 
（4）干擾現象某些病毒感染細胞時不出現CPE或其他易于測出的變化（如HAD），但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風疹病毒感染Vero細胞后CPE不明顯，但能干擾后感染的埃可病毒的增殖，從而阻抑后者特有的CPE。若細胞出現ECHOV感染所特有的CPE，則表示在細胞內無風疹病毒增殖。反之。若培養后Vero細胞不出現特有的CPE，則說明培養細胞中有風疹病毒增殖。 
（5）細胞代謝的改變：感染細胞的結果可使培養液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染后發生了變化。這種培養環境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。 
（6）電鏡觀察：可用電子顯微鏡直接觀察細胞內外的病毒，并可了解病毒的形態及大小。    
   
   

 

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