(1)改良Ryn鞭毛染色法
①玻片的處理。要求用新的載玻片,用前須在95%酒精中浸泡24h以上,用時從酒精中取出,以干凈紗布擦干后使用。
②在玻片上滴蒸餾水兩滴。1張玻片上可同時制2個涂片。
③用接種環挑取血平板上菌少許,將細菌點在玻片上的蒸餾水滴的頂部,一般只需點一下,只允許極少量的細菌進入水滴,不可攪動,以免鞭毛脫落。
④玻片置室溫自然干燥 。
⑤滴加染液于玻片上染色。
⑥約10—15min后,用自來水緩慢沖去染液,沖洗時應避免染液表面的金屬光澤膜滯留在玻片上,影響鏡檢。
⑦玻片自然干燥后,鏡檢時應以涂片的邊緣開始,逐漸移向中心。原因是邊緣細菌較少且相互分開,鞭毛容易觀察。細菌密集的地方鞭毛被菌體擋住,不易觀察。
結果:菌體和鞭毛均染成淡紫色。
(2)硝酸銀染色法
①活化菌種。冰箱中保存的菌種,通常要連續移種1—2次后,接種于新配制的營養瓊脂斜面(表面較濕潤、基部有冷凝水),28—32°培養10—14h,取斜面和冷凝水交接處培養物作染色材料;或點種于新制備的營養瓊脂(含8—10g/l的瓊脂 )平板中央,28—32°培養18—30h,讓菌種擴散生長,取菌落邊緣的菌苔(不要取菌落 中央的菌苔 )作染色材料。
②制備菌液。取斜面或平板菌種培養物數環于盛有1—2ml無菌水的試管中,制成輕度渾濁的菌懸液用于制片。也可用培養物直接制片,但效果往往不如先制備菌液好。
③制片。取一滴菌液于載玻片的一端,然后將玻片傾斜,使菌液緩緩流 向另一端,用吸水紙吸去玻片下端多余菌液,室溫(或 162溫室)自然干燥 。干后應盡快染色。
④染色。滴加硝酸銀染色A液,染3—5min,用蒸餾水充分洗去A液。用B液沖去殘水后,再加B液覆蓋涂片染色約數秒至1min,當涂面出現明顯褐色時,立即用蒸餾水沖洗。若加B液后顯色較慢,可用微火加熱,直至顯褐色時立即水洗。自然干燥 。
⑤鏡檢。用油鏡觀察。觀察時,可從玻片的一端逐漸移至另一端,有時只在涂片的一定部位觀察到鞭毛。
結果:菌體呈深褐色,鞭毛顯褐色。
(3)改良的Leifson染色法
①活化菌種同硝酸銀染色法。
②制片。用記號筆在載玻片反面將玻片分成3—4個等分區,在每一小區的一端放一小滴菌液。將玻片傾斜,讓菌液流到小區的另一端,用濾紙吸去多余的菌液。室溫或37°, 自然干燥 。
③染色。加Leifson染色液覆蓋第一區的涂面,數分鐘后,加染液于第二區涂面,如此繼續染第三區、第四區。在染色過程中注意觀察,當整個玻片都出現鐵銹色沉淀、染料表面出現金色膜時,直接用水輕輕沖洗(不要先傾去染料再清洗,否則背景不清 ),染色時間大約10min。
④鏡檢。自然干燥后,油鏡檢查。
結果:菌體和鞭毛均呈紅色。
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