細菌標本經染色后,與周圍環境在顏色上形成鮮明的對比,可在普通光學顯微鏡下觀察細菌的形態特征。
1、實驗材料
(1)染色液結晶紫溶液、盧戈碘液、95%酒精、稀釋石炭酸復紅液。
(2)菌種大腸桿菌和葡萄球菌6—12h肉湯混合培養物。
(3)其他普通玻片、酒精燈、接種環等。
2、實驗方法
(1)細菌標本片制備
①涂片。取一張潔凈載玻片,將變形桿菌液體培養物直接涂布于載玻片上;或先在載玻片上放置一接種環生理鹽水,再取固體培養基上少許葡萄球菌與生理鹽水磨勻,涂成直徑1cm大小的區域。取菌量不可太多,使鹽水磨成灰白色為宜。
②干燥 。涂片最好在室溫下自然干燥,或將標本面向上,置于酒精燈火焰高處慢慢烘干,切不可放在火焰上燒干。
③固定。干燥后的標本片迅速通過火焰3次,既可達到殺菌的目的,又能固定細菌在玻片上,以免玻片上細菌在染色中被沖洗掉。
(2)染色
①初染。滴加結晶紫液2—3滴于涂片上,作用1min后,用細流水沖洗,甩干。
②媒染。滴加盧戈碘液數滴于涂片上,作用1min后用流水沖洗,甩干。
③脫色。滴加95%酒精數滴,輕輕晃動玻片,使玻片上流下的酒精液無紫色為止(時間靈活掌握,大約0.5min左右),用流水沖洗,甩干。
④復染。滴加稀釋石炭酸復紅液數滴,作用1min后,用流水沖洗,甩干。最后用吸水紙印干標本片或 自然干燥后,玻片上滴加鏡油,用顯微鏡油鏡觀察。
3、實驗結果
葡萄球菌最后被染成紫色,呈葡萄狀排列;變形桿菌被染成紅色,單個散在分布。
4、影響因素
(1)操作因素涂片太厚或太薄,菌體分散不均勻,可影響染色結果。固定時避免菌體過分受熱。脫色時間要根據涂片厚薄靈活掌握。
(2)染液因素:所有染液應防止水分蒸發而影響濃度,特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脫色酒精以95%濃度為宜,若瓶密封不良或涂片上積水過多,可使酒精濃度下降而影響其脫色能力。
(3)細菌因素:不同時間培養物,革蘭染色結果有差異,如葡萄球菌幼齡菌染成紫色,而老齡菌可被染成紅色。細菌染色時一般用18—24h的細菌培養物為宜。
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