一、簡介

?  在實驗室檢驗工作中，經常會從樣品中分離出一些細菌，為了對這些細菌進一步研究，首先需要明確這些細菌的種屬類別。本文主要對未知菌種屬分類的確定方法進行闡述。

??????????????????????????  目前基因測序是最直接快速的菌種確定方法。但是實驗室中，往往還需要采用傳統的鑒定方法進行菌種鑒定。傳統鑒定方法操作簡單，成本低廉，不需要復雜設備，適用于一般實驗室進行菌株鑒定。

二、常見細菌的鑒定方法

?  菌種鑒定是需要專業人員進行操作的一種實驗室活動，為了達到菌種鑒定的目的，一些常規的試驗操作和鑒定方法是必須具備的基本技能。常見的細菌鑒定方法有三大類：形態特征、培養及生理特性、生化特性測定。

  1、形態特征

  （1）革蘭氏染色

  （2）鞭毛染色

  （3）運動性

  （4）芽孢染色

  （5）抗酸染色

  （6）莢膜染色

  2、培養及生理特性

??  （1）菌落形態：用劃線法將菌種接在平板培養基上，適溫培養1d～2d，出現單菌落開始觀察，包括形狀、大小、邊緣、表面、隆起、透明度、菌落和培養基的顏色等。

??  （2）生長溫度和耐熱性：將菌種轉接到幾支試管中，分別在不同溫度下培養，每個溫度設2管，目測生長情況。

??  （3）芽孢菌厭氧性測定：將菌種用接種環穿刺接種在厭氧培養基中，30℃培養，3d和7d分別觀察，表面生長者為好氧菌，如沿穿刺線或下部生長者為兼性厭氧菌或厭氧菌。

??  （4）碳源利用：將菌種接種在各種碳源基礎液體培養基（碳源分別為蔗糖、乳糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇等，終濃度為0.1%～0.2%）中，適溫培養1d，以菌懸液接種，能生長者即培養基變渾濁判為陽性，否則為陰性。

?  （5）氮源利用：將菌種接種在各種氮源基礎液體培養基（氮源分別為氨態氮如磷酸氫二銨或硝態氮如硝酸鉀、乳糖、果糖、木糖、半乳糖等，終濃度為0.2%～0.5%）中，適溫培養1d，以菌懸液接種，能生長者即培養基變渾濁判為陽性，否則為陰性。

?  （6）檸檬酸鹽利用：將菌種接種在檸檬酸鹽基礎液體培養基總，適溫培養3d～7d，培養基變為桃紅色者判為陽性，否則為陰性。

?  （7）耐鹽性和需鹽性：將菌種分別接種在含3%，5%，7%，10%含NaCl的肉汁胨液體培養基中，適溫培養3d、7d，目測生長情況。

??  （8）丙酸鹽利用：將菌種接種在丙酸鹽基礎液體培養基中，適溫培養3d～7d，培養基變為桃紅色者判為陽性，否則為陰性。

  3、生化特性測定

?  （1）氧化酶：將1%的四甲基對苯二胺水溶液滴于干凈培養皿的濾紙上，濾紙濕潤即可，用塑料接種環取18h～24h的菌苔涂抹于濕潤濾紙上，在10s內涂抹的菌苔呈藍色為陽性，60s以上呈藍色者不計，按陰性處理。

??  （2）觸酶：將24h培養的斜面菌種，用塑料接種環取菌苔涂抹于已滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產生則為陽性，無氣泡產生為陰性。

??  （3）葡萄糖氧化發酵：將24h幼齡菌種穿刺接種OF培養基，每株4支，其中2支上面覆蓋石蠟油，適溫培養1d、3d、7d、14d觀察，只有開管變黃者為氧化型，開管和閉管均變黃者為發酵型。

?  （4）甲基紅（MR）：培養48h的菌種試管培養液中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅陽性反應，黃色為陰性反應。

?  （5）V-P測定：將培養24h的菌種培養液，加入V-P試劑，培養液出現紅色，即為試驗陽性反應，有時需要放置更長時間才能出現紅色。

?  （6）淀粉水解：將菌種接在淀粉瓊脂培養基（在肉汁胨中加入0.2%的可溶性淀粉）上，培養2d～5d，形成明顯菌落后，將碘液滴在平板上，觀察菌落周圍有無透明圈。菌落周圍如有不變色的透明圈，表示淀粉水解陽性；仍藍色為陰性。

  （7）脲酶：指示劑變紅者為陽性，不變為陰性。

  （8）苯丙氨酸脫氨酶：變綠為陽性反應，不變為陰性反應。

??  （9）明膠液化：將菌株接種在明膠液化培養基中，25℃～28℃培養，于5d、10d、20d、30d觀察液化程度。

??  （10）牛奶分解：將新鮮菌種接于石蕊牛奶中，25℃～28℃培養，于3d、5d、10d、20d、30d觀察，還原-石蕊褪色變白；胨化-牛奶變清；產酸-石蕊變紅；產堿-石蕊變藍；酸凝和酶凝-牛奶結塊、凝固。

??  （11）硝酸鹽還原：將菌種接種于硝酸鹽液體培養基中，適溫培養1d、3d、5d。用滴加A液及B液溶液變為粉紅色、橙色、棕色等為硝酸鹽陽性，否則為陰性。

上面列出的只是一些常用的生化反應，能幫助細菌鑒定的生化試驗有四十多種，需要時可以查閱資料進行操作。

三、示例說明

  下面以伯杰手冊為依托，詳細事例說明未知細菌的鑒定程序和方法。

  1、十大類群的確定

圖1  常見細菌類群檢索總圖

??  參考“常見細菌類群檢索總圖”（圖1），首先通過測定細胞壁是否含肽聚糖、膜脂是否以脂鍵相連，確定待鑒定菌為真細菌還是古細菌。

??  對于確定是真細菌的菌株，依次通過對光的需求性、產芽孢情況、革蘭氏染色結果和對氧氣的需求情況，確定出屬于哪個大類群。細菌九大類群如下：

  （1）光合細菌

  （2）產芽孢細菌

  （3）好氧或兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌

  （4）好氧或兼性厭氧非發酵型革蘭氏陰性桿菌

  （5）嚴格厭氧的革蘭氏陰性球菌

  （6）革蘭氏陰性、厭氧直桿、彎桿和螺桿菌

  （7）革蘭氏陽性好氧和兼性厭氧球菌

  （8）好氧和兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌

  （9）厭氧的革蘭氏陽性桿菌和球菌

??  2、對于已經確定了大類群的細菌，再按照所屬大類的檢索圖進一步確認其所屬的種屬。例如，通過第一步操作，確定該菌為“好氧或兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌”，則可以通過“好氧或堿性厭氧革蘭氏陰性發酵桿菌檢索圖（圖2）”，進行氧化酶試驗、鞭毛運動性、是否寄生于脊椎動物鳥類、最適溫度<30℃、是否需要NaCl、是否積累PHB、是否具有脂酶、能否利用甘露醇等試驗，進一步找到其所在的科或屬。

?  從圖2可以看出，好氧或兼性厭氧發酵型革蘭氏陰性桿菌類群中共包含7大科屬，分別為腸桿菌科、巴斯德氏菌科、水棲菌屬、發光桿菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬。

圖2  好氧或兼性厭氧革蘭氏陰性發酵桿菌檢索圖

??  3、對于已經確定了科、屬的菌種，再進一步通過相應的檢索表，找到其所在的種屬。例如，待鑒定菌已經確定為腸桿菌科菌種，再參考“腸桿菌科屬、種檢索表（圖3）”進一步通過苯丙氨酸脫羧酶試驗、V-P試驗、明膠液化實驗、鳥氨酸脫羧酶試驗等系列生化試驗，根據試驗結果，最終確定其種屬。

圖3  腸桿菌科屬、種檢索表（部分展示）

  上圖中，可以清晰地確定出奇異變形菌、阪崎腸桿菌、普通變形菌等。

?  4、也可通過“腸桿菌科內種間鑒別表”（圖4），設置系列試驗，根據結果判斷待鑒定菌屬于哪個種。

圖4  腸桿菌科內種間鑒別表（部分展示）

四、簡便方法

?  對于常見細菌，也可以先通過革蘭氏染色，確定其為革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌，對于已經確定的革蘭氏陰性細菌，可以使用我公司快檢產品——博檢系統，直接確認其所在的種屬。有關博檢系統詳情和使用方法等可參考：博檢革蘭氏陰性細菌鑒定系統。

五、參考文獻

  東秀珠,蔡妙英.《常見細菌系統鑒定手冊》（1999）。

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