這是一種最早發展而且目前仍廣泛使用的方法。在DNA重組載?體設計時已經在質粒中裝配了抗生素抗?性基因標記，如四環素抗性基因（Tet^r）、氨芐青霉素抗性基因（Amp^r）、卡那霉素抗性基因（Kan^r）等。當編碼有這些抗藥性基因的質粒攜帶目的基因進入宿主細胞后，細胞就具有了相應的抗生素抗性，如果在篩選平板的培養基中加入有關抗生素，只有含質粒的細胞才能生長。這種方法只能證明細胞中確實已經有質粒存在，但無法保證質粒中已經攜帶了目的基因。為了防止誤檢，人們進一步發展了采用插入缺失的方法，同一質粒中往往有兩種抗藥性基因，在體外重組時故意將目的DNA插入到其中一個抗性基因中，使其失活，這樣得到的宿主??細胞便可在含另一抗生素的培養基中存活，但在兩種抗生素都加入的平板上則不能生長。將這種菌株篩選出來，就能保證細胞中的重組質粒確實已經插入了目的基因。由于需要兩次篩選，操作比較麻煩。

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