一、實驗原理
?? 紫外線是一種最常用的物理誘變因素，它的主要作用是使DNA雙鏈中的兩個相鄰的嘧啶核苷酸形成二聚體，并阻礙雙鏈的解開和復制，從而引起基因突變，最終導致表形的變化，如產生色素能力的消失，喪失合成某種氨基酸的能力，以及抗藥性的變化等。紫外線照射后造成的DNA損傷，一般在可見光照射下，由于光激活酶的作用，可將嘧啶二聚體解開，使其恢復正常，這稱為光復活作用。為避免光復活，當用紫外線進行誘變處理時及處理后的操作都應在紅光下進行，并且應將微生物在黑暗的條件下進行培養。
?? 亞硝基胍（NTG）是一種揮發性的烷化劑，具有很強的誘變作用，它的作用機制主要是引起NTGDNA鏈中G：
C——A：T的轉換，它的殺菌作用雖很低，但在存活菌中突變率很高。故成為超級誘變劑。
?? 艾姆氏試驗的基本原理是利用鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養缺陷型（his-）菌株發生回復突變性能來檢測物質的誘變及致癌性能，此菌株在不含組氨酸的基本培養基上不能生長，但遇有誘變性能的物質后可發生回復突變，因而在基本培養基上也能生長，形成肉眼可見的菌落，因此可以在短時間內，根據回復突變發生的頻率來判定該物質是否具有誘變或致癌的性能。由于有些被檢測的致癌劑需要哺乳動物肝細胞中的羥化酶系統激活后方能顯示致突變物的活性，所以在進行試驗時還需要加入哺乳動物肝細胞內微粒體的酶作為體外活化系統（S-9混合液），提高陽性物的測出率。所以艾姆氏試驗也稱鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體試驗。
二、實驗步驟
（一）紫外線的誘變作用
1.菌懸液的準備
（1）將1299菌株轉接完全培養基斜面，32℃培養24小時。
?? （2）自斜面取一接種環菌接與20ml/250 ml三角瓶的肉湯培養基中，32℃培養18小時。
（3）取培養液離心3000 rpm離心15分鐘，棄去上清液，用生理鹽水洗菌體兩次，再加適量的生理鹽水。顯微鏡直接計數法，使菌體濃度為108個/ml。
2.誘變處理
? （1）吸取上述無菌液10mL于無菌平皿中（皿內放一攪拌子，下為磁力攪拌器），放在15W紫外燈下,距離28.5cm照射60秒，取出放在紅燈下，將上述經誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法，具體可按估計的存活率進行稀釋。
?? （2）取各稀釋率下的菌液0.1 ml接于肉湯培養基中，用黑紙包好，32℃培養48小時。
3.淘汰野生型
? （1）取肉湯培養基3000 rpm離心15分鐘，以生理鹽水洗滌兩次，加到5mL無氮培養基饑餓培養4~6小時。
?? （2）加入與無氮培養基等量的二倍氮培養基，培養3~4小時再加青霉素，使青霉素的最終濃度為200單位/毫升。放置3小時
（3）取上述菌液0.1毫升涂于完全培養基平板上，32℃培養8小時。
4.營養缺陷型菌株的檢出
?? （1）準備完全培養基和基本培養基平板各三個。將劃有若干小格并編號的圓形紙貼到平板的背面。
?? （2）用無菌牙簽選取菌落，分別接種于基本培養基和完全培養基的相應位置，32℃培養24小時。
? （3）在完全培養基上生長而在基本培養基上不生長的菌落，轉接在完全培養基斜面上，32℃培養24~48小時。
5.營養缺陷型類型的鑒定
（1）營養缺陷型分為氨基酸、核酸堿基、維生素三大類物質。
（2）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為108個/ml。
（3）制作基本培養基混菌平板。
（4）待冷凝后分為三個區，標明氨基酸，堿基，維生素，用接種針將相應物質放在各區中間。
（5）37℃培養24小時，觀察生長情況，哪個區生長，就說明缺陷型菌株需要哪類物質。
6.營養缺陷型具體營養要求的鑒定
（1）將待測菌株制成細胞懸液，濃度為108個/ ml。
（2）制作基本培養基混菌平板。
? （3）對于具體氨基酸缺陷型的鑒定，可先將各種氨基酸分為6組，如表1，將待測平皿分為六區，分別將6組氨基酸點在六區中央位置，30℃培養24小時，觀察生長譜（表2）即可確定具體所需要的營養物質。
? （4）核酸堿基缺陷型的鑒定（只做4種物質），將待測平皿分為四區，在中央位置分別點上，黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤，次黃嘌呤，37℃培養24小時，觀察生長情況，即可確定具體所需營養物質。
7.復測
?? 經上述步驟確定的各菌株的營養要求，再以所確定的純一的營養物質所配制的補充培養基復測一次，如果在補充培養基上生長，在對照的基本培養上不生長，則該菌無疑是這種物質的缺陷型。
（二）NTG對谷氨酸棒桿菌1299的誘變效應
1.制備含菌平板
（1）將活化的斜面菌種挑一環接種于5ml的肉湯培養基中，37℃培養過夜。
（2）次日，按5％接種量取上述菌液于肉湯培養基中，37℃培養6－7h。
? （3）取0.2mL菌液于完全培養基平板上，用無菌涂棒將菌液均勻的涂滿整個平板表面，倒置培養2h。
2.誘變處理
? 在上述含菌平板的中央和其他部位放少許NTG結晶，然后將培養皿倒置于37℃恒溫箱中，培養24h。
3.增殖培養
? 放有NTG藥物的周圍有一透明的抑菌圈，緊靠抑菌圈有一個生長較密集的生長圈，用接種環挑取該處菌苔于裝有20mL肉湯培養生物科學與工程系微生物學教學研究室基的三角瓶中，于37℃恒溫箱中，培養過夜，使誘變后的突變體進行繁殖，以增加菌數。
4.淘汰野生型
? （1）培養菌液：取增殖后的菌液5mL于無菌離心管中，3500r/min離心10min，倒去上清夜，再用生理鹽水洗滌兩次，離心，去上清液后的約1/10菌液接種到5mL無氮基本培養基中培養12h。
? （2）加青霉素：取上述菌液5mL加到5mL高滲培養液的三角瓶中，再加入青霉素，使最終濃度約為500單位/mL，再置于37℃恒溫箱中繼續培養6h，離心，棄去上清夜，重新懸浮于5mL無氮基本培養基中置冰箱保存。
?? （3）涂布平板：取上述培養液的原液和10－1、10－2的稀釋液各0.1mL，分別涂布于完全培養基平板上，置于37℃恒溫箱中繼續培養24h，然后選取合適的平板（約長有50－200個菌落）用作營養缺陷型的檢查（如無合適平板，可取保存于冰箱中經青霉素處理過的菌液再行稀釋、涂布）。
5.缺陷型的檢出
同紫外線誘變處理的缺陷型的檢出。
(三)艾姆氏試驗檢測突變回復
1.組氨酸營養缺陷型(his+)鑒定
? 基于菌株只能在含組氨酸的培養基上生長、無組氨酸的培養基上不能生長的原因,將下層培養基融化,冷卻至50℃左右,倒入4個培養皿內,冷凝后倒置過夜制成底層平板。從測試菌株TA100及對照菌株斜面各取一環分別接入肉膏蛋白胨培養液內，37℃，培養16~24h后離心，取菌體并用生理鹽水洗滌3次，然后制成菌懸液（濃度1~2×109/mL）。取氯化鈉瓊脂融化并冷卻至45℃左右，保溫，各管加0.1mL菌液,每個菌株做兩管,迅速搖勻并倒在底層平板上鋪勻.在各培養皿背面用記號比標出1,2,3三??點.翻轉平皿,打開皿蓋,在“1”處加微量的組氨酸顆粒,“2”處滴加組氨酸-生物素混合液1小滴,“3”處不加作為對照。37℃，培養2天，觀察結果，要求結果為檢測菌株為組氨酸-生物素缺陷型。
2.亞硝基胍致突變效應的檢測
（1）自發回復突變對照
? 將下層培養基融化后倒入平皿，制成底層平板。上層培養基融化后冷至45℃左右，加0.1mL菌懸液、0.5mLS-9混合液,不加待測樣品液。經37℃培養48h后，觀察在下層平板上長出的菌落表示為該菌自發回復突變后生成。記錄并算出每組平皿菌落平均數/皿，以Rc表示。
突變率（MR）=每皿誘變菌落均數（Rt）/每皿自發回復突變菌落均數（Rc）
? 只有突變率〉2才認為樣品屬艾姆氏試驗陽性。當試驗樣品濃度達到500μg/皿仍未能出現陽性結果時，便可報告該待測樣品屬艾姆氏試驗陰性。
?? 對于陽性結果的樣品，其試驗結果尚要經統計分析，若計算劑量與回變菌落之間有可重復的相關系數，經相關顯著性檢驗，最后才能確認為陽性。
（2）陰性對照
?? 為說明樣品本身確為艾姆氏試驗陽性而與配制樣品液所用的溶劑無關，所以陰性對照是采用配制樣品時的溶劑。
3.亞硝基胍致突變效應的檢測
取測試菌珠1管接肉膏培養基活化，37℃，培養16~24h后離心，將菌體用生理鹽水洗滌3次，最后配成濃度為1~2×109?/mL菌懸液備用.融化下層培養基并倒入6套平皿制成平板,用記號筆作好標記.做1μg、5μg、10μg三種濃度,每濃度每菌重復兩皿。取上層培養基6管融化并冷卻至45℃左右，標記各管1~6號。每管加TA100菌懸液0.1mL、0.5mLS-9混合液到1~6管.迅速搖勻后,倒在底層平板上,待凝固后在每皿中央放置1片直徑為6mm無菌濾紙片。在1、2各皿的濾紙上滴加濃度為50μg /mL的NTG0.02mL,在3、4各皿濾紙滴加250μg NTG0.02mL,在5、6各皿濾紙滴加500μg NTG0.02mL,即終濃度為1μg、5μg、10μg。37℃，培養48h觀察結果。
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