一、大腸菌群簡介
大腸菌群是革蘭氏陰性、無芽孢、氧化酶陰性的桿狀細菌,為需氧和兼性厭氧,可在有膽鹽(或具有其他抑制生長的表面活性劑)存在的情況下生長,通常可在36℃士2℃發酵乳糖并產酸和醛。具有β-半乳糖苷酶,??在本標準設定的條件下,大腸菌群為能分解β-半乳糖苷,使培養基發出熒光或生成紫色(或紅色)菌落。主要由腸桿菌科中四個屬內的一些細菌所組成,即埃希氏菌屬、檸檬酸桿??菌屬、克雷伯氏菌屬以及腸桿菌屬。
大腸菌群主要來源于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品?中有否污染腸道致病菌的可能。如果大腸菌群存在于食品中,表明未作有效的消毒處理、加工后保存條件不良或消毒后又受到污染。快速檢驗這些細菌,有助于食品的衛生管理,維護消費者的食用安全。
二、參考標準
《GBT 4789.32-2002 大腸菌群的快速檢測》
三、檢驗原理
3.1 最可能(MPN)法
大腸菌群可產生β-半乳糖苷酶,分解液體培養基中的酶底物—4-甲??基傘形酮-β-半乳糖苷(以下簡稱MUGal),使4-?甲基傘形酮游離,因而,在波長366nm的紫外光燈照射下呈現藍色熒光。
3.2 平板法
大腸菌群可產生β?-半乳糖苷酶,分解培養基中的酶底物—茜素-β-D-半乳糖苷(以下簡稱Aliz-gal),使茜素游離并?與固體培養基中的鋁、鉀、鐵、錢離子結合形成紫色(或紅色)的鰲合物,使菌落呈現相應的顏色。
四、檢驗方法以及結果分析
大腸菌群快速檢驗程序見圖1。
圖1 大腸菌群快速檢驗程序
4.1 大腸菌群的MPN計數
4.1.1 檢驗方法
?? 選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管MUGal肉湯管,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料MUGal肉湯管),同時另取2支MUGal肉湯管(或雙料MUGal肉湯管)加入與樣品稀釋液等量的上述無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)作空白對照。將接種后的培養管置于37±1℃培養箱培養18h-24h。
將培養管置于暗處,用波長366nm的紫外光燈照射,如顯藍色熒光,為大腸菌群陽性管;如未顯藍色熒光,則為大????腸菌群陰性管。
培養基檢驗原理:胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是培養基pH緩沖劑;月桂基硫酸鈉可以抑制革蘭氏陽性菌的生長;大腸菌群可產生β-半乳糖苷酶,分解液體培養基中的酶底物4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷MUGal,使4-甲基傘形酮游離,在波長366nm紫外燈照射下??呈現藍色熒光。
培養基用法:稱取本品30.7克,加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中,分裝于20mm×150mm試管中,每管9mL,116℃高壓滅菌10分鐘,待培養基冷卻后,以無菌操作于每管培養液內加入0.1mL經無菌水稀釋的500ug/mL頭孢磺啶??液,備用。
質控菌株接種到MUGal肉湯管中,培養結果如下圖所示:
正常光線下 |
|
a:空白對照;b:大腸桿菌;c:產氣腸桿菌;d:鼠傷寒沙門氏菌;e:金黃色葡萄球菌 圖2 |
|
366nm紫外燈照射下 |
|
a:空白對照;b:大腸桿菌;c:產氣腸桿菌;d:鼠傷寒沙門氏菌;e:金黃色葡萄球菌 圖3 |
4.1.2 結果報告
根據大腸菌群陽性管數,通過查MPN表,報告每100mL(g)食品中大腸菌群MPN值。
4.2 大腸菌群的菌落計數
4.2.1 檢驗方法
用滅菌吸管吸取待檢樣液1.0mL,加入無菌平皿內。每個樣品接種三個連續稀釋度,每個稀釋度接種兩個平皿。于每個加樣平皿內傾注15mL 45~50℃的Aiiz-gal瓊脂,迅速輕輕轉動平皿,使混合均勻。待瓊脂凝固后,再傾注3mL-5mL A??liz-gal瓊脂覆蓋表面。同時將Aliz-gal瓊脂傾人加有1mL上述無菌磷酸鹽緩沖液(或生理鹽水)的無菌平皿內作空白對照。
待瓊脂凝固后,翻轉平板,于37±1℃培養箱培養18h-24h??。取出平板,計數紫色(或紅色)菌落。
培養基檢驗原理:胰酪胨提供碳氮源、維生素和礦物質滿足細菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是培養基pH緩沖劑;月桂基硫酸鈉可抑制革蘭氏陽性菌的生長;大腸菌群可產生β-半乳糖苷酶,分解液體培?養基中的酶底物茜素-β-D-半乳糖苷(Aliz-gal),使茜素游離并與固體培養基中的鋁、鉀、鐵、錢離子結合形成紫色(或紅色)的鰲合物,使菌落呈現相應的顏色。
培養基用法:稱取本品46.7g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中,116℃高壓滅菌10分鐘,備用。
質控菌株接種到Aliz-gal瓊脂中,培養結果如下圖所示:
|
|
|
|
|
大腸桿菌ATCC 25922 |
|
弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43568 |
|
鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028 |
圖4 標準菌株在Aliz-gal瓊脂中生長情況
4.2.2 結果報告
4.2.2.1 當平板上的紫色(或紅色)菌落數不高于150個??,且其中至少有一個平板紫色((或紅色)菌落不少于15個時,按公式1計算大腸菌群數:
公式1:N=∑C/(n1+n2)d
式中:
N—樣品的大腸菌群數,個/mL或g;
ΣC—所有計數平板上,紫色(或紅色))菌落數之總和;
n1—供計數的最低稀釋倍數的平板數;
n2—供計數的高一稀釋倍數的平板數;
d—供計數的樣品最低稀釋度(如10-1,10-2,10-3等)。
4.2.2.2 如接種所有(3個)稀釋樣品的?平板上,紫色(或紅色)菌落數均少于15個時,仍按式(1)計算,但應在所得結果旁加“*”號,表示為估計值。
4.2.2.3 如接種未稀釋樣品和??所有稀釋樣品的平板上,紫色(或紅色)菌落數均少于15個時,報告結果為:每毫升(克)樣品少于15個大腸菌群。
4.2.2.4 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣?品的平板上,均未發現紫色(或紅色)菌落數時,報告結果為:每毫升(克)樣品少于1個大腸菌群。
?? 4.2.2.5 如平板上的紫色(或紅色)菌落數高于150個時,按式(1)計算,在結果??旁加“*”號表示估計值或視情況重新選擇較高的稀釋倍數進行測定。
注:本文屬龙8娱乐官方网站生物原創,未經允許不得轉載。