標準依據：《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》

1 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。

1.1 恒溫厭氧培養箱：37±1℃。

1.2 冰箱：2-5℃。

1.3 天平：感量為0.1g。

1.4 均質器及無菌均質袋、均質杯。

1.5 振蕩器。

1.6 無菌吸管：1 mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。

1.7 無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。

1.8 無菌培養皿：直徑90mm。

1.9 顯微鏡：10倍～100倍 。

1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。

2 培養基和試劑

2.1 MRS( Man Rogosa Sharpe) 瓊脂培養基。

2.2 MRS肉湯培養基。

2.3 無菌生理鹽水。

2.4 革蘭氏染色液。

2.5 細菌生化鑒定試劑盒。

3 檢驗程序

植物乳桿菌檢驗程序見圖1。

圖1 植物乳桿菌檢驗程序

4 操作步驟

4.1 樣品制備

4.1.1 固體和半固體樣品

稱取25g樣品?，置??于225mL生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min-2min制成1：10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中，8000r/min-lO000r/min均質1min～2min制成1：10的樣品勻液。

4.1.2 液體樣品

應先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣??品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液??????????????????????????。

4.2 樣品稀釋

4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿??管壁緩慢注于裝于9mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換??用1次1mL滅菌吸管或吸頭。

4.3 培養

根據對待檢樣品菌含量的估計，選擇2個～3個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取樣品勻液0.1mL?接種于MRS瓊脂平板內，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養基??吸收。翻轉平皿置于37℃±1℃厭氧培養箱中培養48h±2h。

4.4 菌落計數

4.4.1 選取特征菌落數在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。 每個稀釋度的菌落數應采用兩個??平板的平均數。

4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應?以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻。即可計算半個平板?后乘以2，代表一個平板菌落數。

4.4.3 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

4.5 鑒定

4.5.1 菌落挑選和純培養

挑選平板上5個邊緣透明、整齊的菌落分別轉入MRS肉湯培養基37±1℃厭氧培養箱?中培養24h±2h后進??行形態學、生化鑒定。

4.5.2 形態學鑒定

革蘭氏染色、鏡檢。植物乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌，呈直桿狀，長度3.0μm～8.0μm，單個、成對或成鏈狀，通常缺少鞭??毛，無芽孢。

4.5.3 生化鑒定

使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。鑒定特征見附B.1。乳桿菌屬常見菌種主要鑒別特征參見表C.1。

5 結果計算

5.1 每個平板中植物乳桿菌的數量

每個平板中植物乳桿菌菌落數的計算見式(1) :

  a=b/A×C      ??        &?nbsp;...............（1）

  式中：

  a—每塊平板上的植物乳桿菌菌落數；

  b—挑取后經證實為植物乳桿菌的菌落數；

  A—挑取平板上用于驗證的菌落數；

  C—平板上的所有特征菌落數。

5.2 菌落總數的計算方法

5.2.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板中植物乳桿菌菌落數的平均值，再將平均值乘?以相應稀釋倍數，作為每克（毫升）中菌落總數結果。

5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式(2)計算：

  N=∑C/（n₁+0.1n₂）×d       ...............（2）

  式中：

  N—樣品中菌落數；

  C—平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；

  n_1—第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；

  n₂—第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；

  d—稀釋因子（第一稀釋度）。

6 報告

6.1 結果判定

若樣品菌落符合植物乳桿菌形態學及生化鑒定的特征，可判定為植物乳桿菌。

6.2 結果報告

6.2.1 定性報告

在25g(mL)樣品中檢出或未檢出植物乳桿菌。

6.2.2 定量報告

菌落數小于1?00CFU時，以整數報告。菌落數大于或等于100CFU時??，對第3位數字進行修約后，取前2位數字，后面用0代替位數； 也可用10的指數形式來表示，采用兩位有效數字。

  本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。

附：

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