一、參考標準

  食品國標GB4789.30-2016《食??品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌??檢驗》

二、檢驗流程

  單增李斯特氏菌計數有兩種方法：MPN法和平板計數法。

 （一）MPN法

  1、樣品稀釋均質

  無菌操作稱取樣品25g(mL),?放入盛有225mL LB1的無菌均質袋內(或均質杯)內，振蕩混勻,制成1∶10的樣品勻液。

  用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶??10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。

  制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。

  2、接種和培養

  選取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),接種于10m??L LB1肉湯,每一稀釋度接種3管,每管接種1mL(如果接種量需要超過1mL,則用雙料LB1增菌液)于30℃±1℃培養24h±2h。每管各移取0.1mL,轉種于10mL LB2增菌液內,于30℃±?1℃培養24h±2h。如圖1所示。

圖1

  用接種環從各管中移取1環,接種李斯特氏菌顯色平板,36℃±1℃培養24h-48h。菌落形態應為藍綠色菌落，帶白色暈環，如圖2所示。自每塊平板上挑取5個典型菌落(5個以下全選)。

圖2

  3、結果判定

  根據證實為?單核細胞增生李??斯特氏菌的陽性管數，查最可能數（MPN）檢索表，報告每g (mL)單核細胞增生李斯特氏菌的MPN值。

  在10^-1-10^-5五個連續稀釋度中確定最適的三個連續稀釋度方法如下：

  a）有一個以上的稀釋度3管均為陽性。選擇三管都是陽性結果的最高稀釋度及其相連的兩個更高稀釋度（??見示例a、b，表中帶下劃線的數字對應的接種樣品量為最終選取的最適稀釋度，下同）；

  b）在未選擇的較高稀釋度中還有陽性結果時，則順次下移到下一個更高三個連續??稀釋度（見示例c）；

  如果??中間有某個稀釋度沒有陽性結果，但更高稀釋度有陽性結果，則將此陽性結果加到前一稀釋度，進而確定三個?連續稀釋度（見示例d）；

  如果不能按照這個原則找到三個合適的稀釋度，則選擇前一個較低的稀釋度（見表示例e）；

  c）沒有任何一個稀釋度3管均為陽性。如果沒有一個稀釋度的3管均為?陽性，則選擇三個最低稀釋度（見示例f）；

&n??bsp; 如果在更高的沒有被選擇的稀釋度還有陽性結果，將此陽性結果加到選擇的最高稀釋度，進而確定三個連續稀釋度（見示例g）。

  舉例說明：若單核細胞增生李斯特氏菌的陽性管數的示例為3-3-2-0-1，則選擇的稀釋度為3-??2-1，根據MPN檢索表所得樣品中含有單核細胞增生李斯特氏菌為1500?CFU/g（mL）。

 （二）平板計數法

  1、平板計數

  樣品均質，如MPN法均質，所用均質的稀釋液為BPW或LB。

  選取2個-3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板上。倒置于培養箱,36℃±1℃培養24h-48h。菌落形態應為藍綠色菌落，帶白色暈環。如圖3所示。

圖3

  選擇有典型單核細胞增生李斯???特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在15CFU-150CFU之間的平板,計數典型菌落數。分以下6種情況：

  ①只有一個稀釋度的平板?菌落?數在15CFU-150CFU之間且有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落；

  ②所有稀釋度的??平板菌落數均小于15CFU且有典型菌落,應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；

  ③某一稀釋度的平板菌落數大于150CFU且有典型菌落,但下一稀釋度平板??上沒有典型菌落,應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

 ??; ④所有稀釋度的平板菌落數大于150CFU且有典型菌落,應計數最高稀釋??度平板上的典型菌落；

  ⑤所有稀釋度的平板菌落數均不在15CFU-150CFU之間且有???典型菌落,其中一部分小于15CFU或大于150CFU時,應計數最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落；

  ⑥2個連續稀釋度的平板菌落數均在15CFU-150CFU之間按照公式二計算。

  2、結果計算

  公式一：T=AB/Cd

  注：T：樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落。A：某一稀釋度典型菌落的總數。B：某一稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C：某一稀釋度用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。d：稀釋因子。

&??nbsp; 例如，稀釋100倍之后，三個平板典型菌落為80個，取5個典型菌落做鑒定，3個為陽性菌。

  公式一計算：T=80×3/（5×10^-2）=4800CFU/g（mL）

  公式二：T=（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1d

  注：T：樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落。A1：低稀釋度典型菌落的總數。B1：低稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C1：低稀釋度用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。A2：高稀釋度典型菌落的總數。B2：高稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C2：高稀釋度用于單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。d：稀釋因子（低稀釋梯度）。

  例??如，稀釋10倍之后，三個平板典型菌落??為80個，取5個典型菌落均做鑒定，3個為陽性菌。稀釋100倍之后，三個平板典型菌落為10個，取5個典型菌落做鑒定，2個為陽性菌。

  公式二計算：T=（80×3/5+10×2/5）/（1.1×10^-1）=473CFU/g（mL）

  3、結果報告

  報告每g(mL)樣品中單核細胞增生?李斯特氏菌菌數,以CFU/g(mL)表示；如T值為0,則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

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