一、參考標準

  《SN/T 2206.3-2009 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準 ?化妝品微生物檢驗方法 第??3部分：肺炎克雷伯氏菌》。

二、生物學特征

  革蘭氏陰性桿菌，為較短粗的桿菌，大小0.5～0.8×1～2 um，單獨、成雙或短鏈狀排列。無芽胞，無鞭毛，有較厚的莢膜，多數有菌毛。營養要求不高，在普通瓊脂??培養基上形成較大的灰白色粘液菌落，以接種環挑之，易拉成絲，有助鑒別。在腸道桿菌選擇性培養基上能發酵乳糖，呈現有色菌落。

三、檢驗程序

圖1 肺炎克雷伯氏菌檢驗程序

四、檢驗方法及結果

  1、增菌

  肺炎克雷伯氏菌在SCDLP液體培養基中36±1?℃培養18-??24h后生長渾濁。如圖2所示。

a:空白對照 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖2 SCDLP液體培養基培養結果

  2、選擇性分離

  自SCDLP培養液中，取1-2接種??環，劃線接種于膽硫乳瓊脂平板（DHL）上，置36±1℃ 培養18?-24 h。

  在DHL平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉紅色，大而?隆起，光滑濕潤，粘液狀，相鄰菌落容易融合成膿汁樣，接種針挑取菌落時呈絲狀粘連。如圖3所示。

圖3 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117在DHL平板上的培養結果

五、初步生化鑒定

  從DHL平板上至少挑取5個典型或可疑菌落，如果平板上可疑菌落少于5個，則全部挑取，把挑取的可疑菌落分別穿刺于動力半固體瓊脂，并接種?到營養?瓊脂斜面培養基，36±１℃培養18-24 h。將營養瓊脂斜面培養基上的純培養物做革蘭氏染色、氧化酶試驗。

  1、動力半固體瓊脂

  肺炎克雷伯氏菌在動??力半固體培養基中無動力，延穿刺線生長。如圖??4所示，相比較大腸埃希氏菌在動力半固體培養基中有動力，呈擴散生長，培養基會出現渾濁現象。

a:大腸埃希氏菌ATCC 25922 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖4 動力半固體培養基培養結果

  2、革蘭氏染色

  肺炎克雷伯氏菌染色結果為紅色，為革蘭氏陰性菌。

圖5

  3、氧化酶試驗

  肺炎克雷伯氏菌氧化酶試驗不變色，為陰性。如圖6所示，相比較銅綠假單胞菌變藍為陽性。

a:銅綠假單胞菌ATCC 9027   b:肺炎克雷伯氏菌??CMCC(B)??46117

圖6 氧化酶試驗結果

六、后續生化鑒定

  挑取無動力，革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性的菌進行后續生化鑒定。

  1、尿素酶試驗

  劃線接種于尿素酶生化管培養基中，培養??基變為粉紅色，為陽性。相比較鼠傷寒沙門氏菌不變色，為陰性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117?  c:鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

圖7 尿素酶鑒定試驗結果

  2、靛基質生化鑒定試驗

  將菌接種于胰蛋白水培養基中，36±1℃培??養24±2h。培養結束后，滴加Kovacs氏靛基質試劑2-4滴，立即觀察現象。肺炎克雷伯氏菌為黃色環，為陰性。相比較大腸埃希氏菌為玫紅色環，為陽性。

a:空白對照??  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大腸埃希氏菌ATCC??25922

圖8 靛基質鑒定試驗結果

  3、MR鑒定試驗

  用MR-VP培養基培養結束后，滴加甲基紅試?劑，立即觀察現象，肺炎克雷伯氏菌顯黃色，為??陰性。相比較大腸埃希氏菌顯紅色，為陽性。

a:???空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大腸埃希氏菌ATCC25922

圖9 MR鑒定試驗結果

  4、V-P鑒定試驗

  用MR-VP培養基培養結束后，滴加V-P試劑，繼續培養0.5-4 h，觀察現象。肺炎克雷伯氏菌變紅，為陽性。相比較大腸??埃希氏菌為黃色，為陰性。

a:空白?對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c?:大腸埃希氏菌ATCC25922

圖10 V-P鑒定試驗結果

  5、西蒙氏枸櫞酸鹽利用試驗

  劃線接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養基上，培養基變藍，為陽性。

a:空白對照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

圖11 西蒙氏枸櫞酸鹽培養基培養結果

  6、賴氨酸脫羧酶鑒定試驗

  接種于賴氨酸脫羧酶肉湯?生化管中，用無菌液體石蠟覆蓋培養基液面，培養18-24 h。??觀察現象，肺炎克雷伯氏菌培養基呈紫色，為陽性。相比較，福氏志賀氏菌培養基呈黃色，為陰性。

a:空白對照  b:肺炎克雷?伯氏菌CMCC(B)46117  c:福氏志賀氏菌ATCC1202?2

圖12 賴氨酸脫羧酶鑒定試驗結果

  注：肺炎克雷伯氏菌生化特性見下表。

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