一、檢驗標準

  《GB4789.13-2012 食品安全國家標準 食??品微生物學檢驗 產氣莢膜梭菌檢驗》

二、檢驗過程解析及注意事項

  1.樣品制備

  無菌稱取25g樣品加入至含?225mL0.1%蛋白胨水的均質袋中，均質1-2min，將制備好的樣品液用含9mL0.1%蛋白胨水試管進行十倍系列稀釋樣液；

  注意事項：產氣莢膜梭菌為厭氧菌，暴露在空氣中易死亡，因此從稱樣、制備樣??液、稀釋、到傾注培養基進行培養整個過程要快速完成，如不能及時完成，可按標準要求置于2-5℃保存（數小時內）或加入緩沖-甘油??氯化鈉溶液置于-60℃冷凍保存。

  2.分離計數

  吸取制備好的樣液加入至無菌空平皿中，加入約15mL的TS?C培養基（冷卻至50℃左右），混合均勻；待培養基凝固后，在上方??覆蓋約10mL的TSC培養基，凝固后置于厭氧環境內36±1℃培養20-24h；培養結束后，計數黑色菌落；

  注意事項：

 （1）注意傾注時的培養基溫度和時間，培養基溫度過高或操作時間過長?都有?可能導致產氣莢膜梭菌死亡；

 （2）覆蓋培養基可防止菌落蔓延，并使產氣莢膜梭菌菌落呈黑色（PS：部分產氣莢膜梭菌若生長在培養基表面時會因產生的硫化氫逃逸，菌落?呈現無色，導致漏檢，覆蓋培養基則可以留住硫化氫與培養基中的鐵鹽反應生成黑色的FeS，使菌落呈現黑色，??因此必須要進行覆蓋操作）。

  3.分離純化培養

  用接種針（環）從TSC平板上挑取黑色菌落，接種至液體硫乙醇酸鹽培養基中，????36±1℃培養18-24h；

  注意事項：液體硫乙醇酸鹽培養基自身可形成厭氧環境，無需覆蓋石蠟或置于厭氧環境培養（不可振蕩培養，液體流動會破壞下層的厭氧環境），接種前注意氧化層的高度（可在臨用前水浴加熱驅氧），接種時需至氧化層以下，產氣莢膜梭菌可在氧化??層以下呈顆粒或條狀生長，有時可見產氣，在培養基表面生成大量氣泡。詳情請參考：液體硫乙醇酸鹽培養基原理及注意事項

  4.產氣莢膜梭菌鑒定

  鑒定試驗：純化后的可疑菌做革蘭氏染色，并做暴烈發酵試驗、乳糖-明膠試驗和動力-硝酸鹽試驗。典型的產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌，有時可見芽孢，暴烈發酵試驗陽性，乳糖陽性，明膠陽性，硝酸鹽還原?陽性，動力陰性。

  暴烈發酵試驗：圖1中a，b為產氣莢膜梭菌暴烈發酵試驗結果，c為陰性對照，d為空白管。接種時使用移液管或移液槍吸取1mL的FTG培??養物伸入至含鐵牛奶試管中培養基液面下方，緩慢加入菌液，更易觀察到明顯的暴烈發酵現象。

圖1暴烈發酵試驗現象

  乳糖-明膠試驗：產氣莢膜梭菌可發酵乳糖，使培養基變黃，并液化明膠，使培養基呈液態不凝固。

  注意事項：

 （1）產氣莢膜梭菌為厭氧菌，此生化反應需大量接種更易看到試驗結果，實際操作時若用接種針挑取FTG培養物直接接種需氧培養，可能會遇到由于接種量不足和需氧培養導致菌不生長的情況，可以采用吸取0.1mL的FTG培養物或挑取平板上的大量菌苔接種方式后厭氧培養，更易觀察??到試驗結果；

 （2）明膠的凝固點在30℃左右，因此在36℃培養結束時，明膠是呈液態的，所以必須要?放入低溫環境使培養基冷卻，再觀察培養基是否呈液態狀；

 ??（3）不同細菌液化明膠能力有差別，增菌接種量可以更快觀察到明膠液化現象，因此遇到明膠不液化問題時，可以嘗試增大接種量或延長培養時間?再觀察試驗結果。

圖2產氣莢膜梭菌的乳糖-明膠試驗現象

  動力-硝?酸鹽試驗：產氣莢膜梭菌無動力，在培養?基中沿穿刺線生長；硝酸鹽還原陽性，加入硝酸鹽還原試劑后變紅。

  注意事項：

 （1）同乳糖-明膠試驗，用接種針挑取FTG培養物穿刺接種需氧培養可能觀察不到菌生長，可?采用接種針挑取菌苔穿刺接種方式進行培養，再觀察結果；

 （2）觀察硝酸鹽還原試驗時，若滴加試劑后不變紅，原因有2：①由于細菌不還原硝酸鹽（-?），②細菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，又繼續將亞硝酸鹽還原為氮氣、氨、氮氧化物等（+）；因此當出現滴加試劑不變紅時，需要補加鋅粉或鋅粒，檢測培養基中的硝酸鹽是否存在。鋅可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽??，加入鋅之后若出現緩慢變紅現象，說明培養基中有硝酸鹽存在，未被細菌還原，可判為硝酸鹽還原陰性；加入鋅之后若沒有顏色變化，說明培養基中的硝酸鹽已全部被細菌還原，也可判為硝酸鹽還原陽性。

圖3產氣莢膜所的動力-硝酸鹽試驗現象

三、試驗結果說明及其他鑒定試驗

  檢驗結果在TSC上呈黑色菌落，革蘭氏染色為陽性?短桿菌，生化鑒定符合暴烈發酵（+），乳糖（+），明膠（+），動力（-），硝酸鹽還原（+），即可判為產氣莢膜梭菌。

  在《GB8538-2??016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》標準中，對產氣莢膜梭菌鑒定有一項卵黃試驗，產氣莢膜梭菌會產生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，在菌落周圍形成沉淀環，該特征反應也可做?為產氣莢膜梭菌的鑒定補充試驗。

a:金葡菌ATCC6538乳白色菌落無渾濁帶

b:產氣莢膜梭菌ATCC13124乳白至淡黃色菌落有較大渾濁帶

圖4產氣莢膜梭菌卵黃試驗現象

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