一、目的要求
學習并掌握制備微生物及核酸電鏡樣品的基本方法．
二、電子顯微鏡與光學顯微鏡的主要區別
顯微鏡的分辨率取決于所用光的波長．1933 年開始出現的電子顯微鏡正是由于使用了彼長比可見光短得多的電子束作為光源，使其所能達到的分辨率較光學顯微鏡大大提高。而光翻的不同，也決定了電子顯微鏡與光學顯微鏡的一系列差異 
根據電子束作用于樣品的方式的不同及成像原理的差異，現代電子顯微鏡已發展形成了許多種類型，目前最常用的是透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡，前者總放大倍數可在1000~ 1000000 估范圍內變化，后者總放大倍數可在20~3 000000 倍之間變化．本實驗主要介紹這兩種顯微鏡樣品的制備．
三、器材
1 菌種大腸桿菌（大腸埃希氏菌）斜面．
2 ．溶液或試劑醋酸戊脂，濃硫酸，無水乙醇，無菌水，2 ％磷鎢酸鈉（pH6 . 5 一8.0 ）水冷液，。3 ％聚乙烯甲醛溶液，細胞色素c ，醋酸鐵，質粒PBR322 . 
3 ．儀器或其他用具普通光學顯微鏡，銅網，瓷漏斗，燒杯，平皿，無菌滴管，無菌鑷子．大頭針，載玻片，細菌計數板，真空鍍膜機，臨界點干燥儀等
四、操作步驟
（一）透射電鏡的樣品制備及觀察
1 ．金屬網的處理
光學顯微鏡的樣品是放置在載玻片上進行觀察，而在透射電鏡中，由于電子不能穿透玻璃，只能采用網狀材料作為載物．通常稱為載網．載網因材料及形狀的不同可分為多種不同的規格，其中最常用的是2 陽～400 目（孔數）的釗網。網在使用前要處理，除去其上的污物，否則會影響支持膜的質量及標本照片的清晰度。本實驗選用的是400 目的銅網，可用如下方法進行處理：首先用醋酸戊酷授漂幾小時，再用蒸餾水沖洗數次，然后再將銅網浸漂在無水乙醇中進行脫水。如果銅網經以上方法處理仍不干凈時，可用稀釋的濃硫酸（l : l ）浸1~2 min ，或在1%NaOH 溶液中煮沸數分鐘．用蒸餾水沖洗數次后，放人無水乙醇中脫水，待用．
2 ．支持膜的制備
在進行樣品觀察時，在載網上還應覆蓋一層無結構、均勻的薄膜．否則細小的樣品會從載網的孔中漏出去，這層薄膜通常稱為支持膜或載膜．支持膜應對電子透明，其厚度一般應低于20nm ；在電子束的沖擊下，該膜還應有一定的機械強度，能保持結構的穩定，并擁有良好的導熱性；此外，支待網在電鏡下應無可見的結構，且不與承載的樣品發生化學反應，不干擾對樣品的觀察，其厚度一般為15nm左右．支持膜可用塑料膜｛如火棉膠膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金屬膜（如鍬膜等） ．常規工作條件下，用塑料膜就可以達到要求，而塑料膜中火棉膠膜的制備相對容易．但強度不如聚乙烯甲醛膜．
( l ）火棉膠膜的制備在一干凈容器〔 燒杯、平皿或下帶止水夾的瓷漏斗）中放人一定量的無菌水，用無菌滴管吸2 ％火棉膠醋酸戊醋溶液，滴一滴于水面中央，勿振動，待醋酸戊酪蒸發，火膜膠則由于水的張力隨即在水面上形成一層薄膜．用鑷了將它除掉，再重復一次此操作，主要是為了清除水面上的雜質．然后適量滴一滴火棉膠液于水面，火棉膠液滴加量的多少與形成膜的厚薄有關，待膜形成后檢查膜是否有皺折，如有，則除去一直待膜制好．
( 2 ）聚乙烯甲醛膜的制備
① 洗下凈的玻璃板插人0.3％formvar 溶液中靜置片刻（時間視所要求的膜的厚度而定），然后取出稍稍晾干使會在玻確板上便形成一層薄膜；
② 用鋒利的刀片或針頭將膜刻一矩形；
③ 將玻板輕輕斜插進盛滿無菌水的容器中，借助水的表面張力作用使膜與玻片分離并漂浮在水面上．
3.轉移支持膜到載網上，可有多種方法，常用的有如下二種：
〔 l ）將洗凈的網放人瓷漏斗中，漏斗下套上乳膠管，用止水夾控制水流，緩緩向漏斗內加入無菌水，其量約高1cm ；用無菌鑷子尖輕輕排除銅網上的氣泡，并將其均勻地櫻在漏斗中心區域；按2 所述方法在水面上制備支持膜，然后松開水夾，使膜緩緩下沉，緊緊貼在銅網上；將一清潔的濾紙筱蓋在翻斗上防塵，自然干燥或紅外線燈下烤干．千澡后的膜，用大頭針尖在銅網周圍劃一下，用無菌攝子小心將銅網膜移到載玻片上，置光學顯微鏡下用低倍鏡挑選完整無缺，厚薄均勻的銅網膜備用
( 2 ）按2 所述方法在平皿或燒杯里制備支持膜，成膜后將幾片銅網放在膜上．再在上面放一張濾紙，浸透后用銀于將濾紙反轉提出水面．將有膜及銅網的一面朝上放在干凈平皿中，置40 ℃ 烘箱使干燥．
4 ．制片
透射電鏡樣品的制備方法很多，如超薄切片法、復型法、冰凍蝕刻法、滴液法等，其中滴液法，或在滴液法基礎上發展出來的其他類似方法如直接貼印法、噴霧法等主要被用于觀察病毒粒子、細菌的形態及生物大分子等．而由于生物樣品主要由碳‘氫、氧、氮等元素組成，散射電子的能力很低，在電鏡下反差小，所以在進行電鏡的生物樣品制備時通常還須采用重金屬鹽染色或金屬噴鍍等方法來增加樣品的反差，提高觀察效果。例如負染色法就是用電子密度高，本身不顯示結構且與樣品幾乎不反應的物質吃如瞬鎢酸鈉或磷鎢酸鉀）來對樣品進行“染色，．由于這些重金屬鹽不被樣品成分所吸附而是沉積到樣品四周，如果樣品具有表面結構，這種物質還能穿透進表面上凹陷的部分，因而在樣品四周有染液沉積的地方，散射電子的能力強，表現為暗區，而在有樣品的地方散射電子的能力弱，表現為亮區，這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來．負染色法由于操作簡單，目前在進行透射電鏡生物樣品制片時比較常用．本實驗將主要介紹采用滴液法結合負染色技術觀察細菌及核酸分子的形態．
五、實驗報告
1 ．結果
描述你所制備的細菌和PBR322 質粒DNA 電鏡制片在電子顯傲鏡下所觀察到的形態特點．
2 思考題
( l ）利用透射電子顯微鏡來觀察的樣品為什么要放在以金屬網作為支架的火棉膜（或其他膜）上？而掃描電子顯微鏡則可以將樣品固定在蓋玻片上？
（2）用負染色法制片時，磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀起什么作用？
 
   

 

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