無菌檢查法系……未發現微生物污染。

  無菌檢查應在無菌條件下進行，試驗環境必須達到無菌檢查的?要求，檢驗全過程應嚴格逄守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及受控環境應定期按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現行國家標準進行潔凈度確認。隔離系統應定期按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗需對試驗環境進行監測

 

  學習：“應在無菌條件下?進行”，這句話此版藥典仍是如此表述，沒有實力改造的情況下，C+A級送風環境應該還能再次維持一個藥典周期吧。“受控”兩個字為新增，對于檢驗潔凈環境，受控主要的關注指標應該是懸浮粒子、浮游菌和沉降菌，當然其它如壓差、溫濕度等的指標和監測頻度也應滿足9205《藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則》的要求。

 

  培養基

  ……（未變化，略）。

  培養基的制備及培養條件

  培養基可按以下處方制備，亦可?使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基或商品化的預制培養基。配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養基若不即時使用，應置于無菌密閉容器中，在2～2?5℃、避光的環境下保存，并在經驗證的保存期內使用。

 

  學習：由原來的的“成品培養基”調整為“商品化的預制培養基”，更易于理解。應注意最后標紅的調整內容。不再強調“非密閉-三周”、“密閉-一年”的規定，便于實踐掌握并防止浪費，更適合國情；當然，你最好有一個穩健的驗證過程??和結果，以支持你的封閉條件和保存周期。

 

  1.硫乙酵酸鹽流體培養基

  ……葡萄糖／無水葡萄糖5.5g/5.0g刃天青溶液1. 0ml…………分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培??養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2。滅菌。在??供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/3 ,否則……

 

  學習：配方中允許使用葡萄糖。配制滅菌后的培養基使用前質量檢查，氧化層由原來的“1/5?”調整為現在的“1/3”，雖然現在看似標準變松了，但確實更符合檢驗實踐，也更容易判斷。

 

  2.～7.……（省略）

  8.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)

 

  學習：新增一種培養基，用于菌液制備中“黑曲”的增菌培養。對于培養基，尤其是干粉培養基，你真的需要核對標簽上的處方，避免與藥典的差異。

 

  培養基的適用性檢查

  無菌性檢查：無菌檢查用的……或與供試品的無菌檢查同時進行。

  ??無菌性檢查每批培養基一般隨機取不少于5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無菌生長。

 

  學習：應考慮實踐中用于無?菌性檢查培養的試管裝滅菌培養基與無菌檢驗用的三角瓶裝培養基在滅菌方法驗證時的兩種包裝的溫??度、F0等結果。否則，也不要在乎那幾瓶了。這里的支/瓶，應該分別對應管法和膜法。

 

  菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌?株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為?第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學特性。

  ……（CMCC一堆數字，略）

 

  學習：這個“確認”在15版藥典時，放在了9203《藥品微生物實驗室質量管理指導原則》中，要求“標準貯備菌株應進行純度??和特性確認。……必要時，實驗室應對工作菌株的特性和純度進行確認。”也就是說，菌種的確認不在作為指導原則存在，而應該落實在文件、實踐中了。已知菌種確認的方法有菌落形態觀察描述/拍照、生化檢定/生化試劑盒、DNA……

 

  菌液制備

  接種金葡、銅綠、枯草的新鮮培養物至胰酪大豆陳液體培養基中或胰酪大豆陳瓊脂培養基上，接種生抱梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養18～24小時；接種白念的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25℃培養2～3天，上述培養物用pH7. 0?無菌氯化鈉－蛋白脈緩沖液或0. 9％無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度菌懸液。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，20～25℃培養5～7天或直到獲得豐富的孢子，加入適量含0. 05%(ml/ml)聚山梨酯80的……。然后，采用適宜的方法吸出抱子懸液至無菌試管內，用……制成適宜濃度的孢子懸液。

 

  學習：白念的培養時間由24～48小時調整為2～3天；終于白念可以長得很好了，菌懸液不再強制要求100cfu/m?l以下（下文取用量也調整為不大于100cfu/ml）；洗黑曲孢子的聚山梨酯80的溶液不再強制3～5ml，應根據孢子的噴落量靈活調整。

  一個圖簡介菌種類型

  菌懸液若在室溫下放置，一般應在2小時內使用……在驗證過的貯存期內使用。

  培養基接種：取適宜裝量的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種不大于l00cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生抱梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的胰酪大豆陳液體培養基7支，分別接種??不大于100cfu的枯草?芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細菌的培養管培養時間不超過3天，接種真菌的培養管培養時間不得超過5天。逐日觀察結果。

 

  學習：確實，真菌培養時間要稍微長一些，??其它的3天之內生長很好了，時間長了反而污染環境或者造成其他實驗室危害。這樣改操作性更強了。修訂專性需氧菌的培養基用量，不再強制要求9ml。刪除“逐日觀察結果”（不僅此處，無菌檢查的樣品觀察也同步修改了，見?后文）。

  結果判定：空白對照管應無菌生長……檢查符合規定。

  稀釋液、沖洗液及其制備方法

  稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

  1.……必要時濾過使澄清……。

  2.……必要時濾過使澄清……。

  根據供試品的特性……加入表面活性劑或中和劑等。

  方法適用性試驗

  進行產品無菌檢查時，應進?行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產??品的無菌檢查。若檢驗程序或產品發生變化可能影響檢驗結果時，應重新進行方法適用性試驗。

 

  學習：這里“檢驗程序”應結合9203《藥品微生物實驗室質量管理指導原則》和1101仔細思考。

 

  方法適用性試驗按……進行方法確認。

  菌種及菌液制備

  金葡、枯草、生孢、白念、黑曲霉的菌株及菌液制備?同培養基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

  學習：大腸埃希菌未參與培養基靈敏度檢查，在1101中，只參與方法適用性。

 

  薄膜過濾法：按供試品的無菌檢查要求，取每種培養基規定接種的供試品總量，采用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入不大于100cfu的試驗菌，過濾。加培養基至濾筒內， 接種金葡、大腸、生孢的濾筒內加硫乙醇酸鹽流體培養基；接種枯草、白念、黑曲霉的濾筒內加胰酪大豆脈液體培養基??????????????????????????。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規定溫度培養，培養時間不得超過5天。

  學習：哪種菌加入哪種培養基內明確出來，防止錯誤，利于方法學實踐。

  直接接種法：取符合直接接種法培養基用量??要求的硫乙醇酸鹽流體培養基6管，分別接人不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生抱梭菌各2管；取符合直接接種法培養基用黛要求的胰酪大豆脈液體培養基6管，分別接人不大于100cfu的枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霖各2管。其中1管按供試品的無菌檢查要求，接入每支培養基規定的供試品接種最??，另1管作為對照，置規定的溫度培養，培養時間不得超過5天。

  結果判斷：與對照管比較……并重新進行方法適用性試驗。

  方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。 

  供試品的無菌檢查

  無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質允許，應?采用薄膜過濾法。供試品?無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。

  學習：考驗方法學確認的設計和檢驗SOP的設計是否能夠緊密聯系。

?  無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。

  檢驗數量：檢驗數量……不包括陽性對照試驗的供試品用量。

  檢驗量：是指供試??品每個??最小包裝接種至每份培養基的最小量（g或ml）……若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠……全部過濾。

  學習：這里注意“裝量”，裝量不是規格量??，這個指標要在方法學階段結合理化的測試結果考慮。這也是“檢驗程序”的一部分，若裝量有改變，方法學就要考慮考慮了。“表??3”有調整，見后文。

  陽性對照 應根據……加菌量不大于100cfu ,供試品用量同供試品無菌檢??查時每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養不超過5天， 應生長良好。

 

  學習：陽性對??照的培養時間由72小時內，調整為“不超過5天”。考慮特殊情況下陽性菌生長慢的情況。建議較好設計批檢驗記錄，減少無??謂勞動量。

 

  陰性對照：供試品……不得有菌生長。

  供試品處理及接種培養基

  操作時，……內容物。

  除另有規定外……接種培養基。

  1.薄膜過濾法

  薄膜過濾法一般應采用封閉式薄膜過濾器，??根據供試品及其溶劑的??特性選擇濾膜材質。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大于0.45μm。濾膜直徑約為50mm,若使用其他尺寸的濾膜，應對稀釋液和沖洗液體積進行調整，并重新驗證。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。

水溶性供試?液過濾前，一般應先將少?量的沖洗液過濾……若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml,總沖洗量一般不超過500ml,最高不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。

 

  學習：2020版藥典在此節的第一段行文順序進行了調整。紅色部分為增加內容。?注意“總沖洗量一般不超過500ml”的規定。

 

  水溶性液體供試品 取規定量……。

  水溶性固體和半固體供試品 取規定量……。

  學習：“半固體供試品”為新增樣品類型。

  可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品：取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中（無菌十四烷酸異丙酯的制備可采用薄膜過濾法過濾除菌，選用孔徑為0. 22μm的適宜濾膜，或其他適宜的滅菌方法），……或將各容器置— 20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位或閥門，正置容器，用無菌鋼錐或針樣設備以無菌操作迅速在與容器閥門結構相匹配的適宜位置鉆一小孔，……?。

  裝有藥物的注射器供試品……。

  具有導管的醫療器械（輸血、輸液袋等）供試品：除另??有規定外，取規定最，每個最小包裝用適量的（通常50～100ml)沖洗液分別沖洗內壁，收集沖洗液于無菌容器中，然后照水溶性液體供試品項下方法操作。同時應采用適宜的方法對包裝中所配帶的針頭等要求無菌的部?件進行無菌檢查。

 

  學習：增加了“除另有規定外”，有單?獨批準的情況應照相應正文執行。本節最后一句進行了調整，表述更準確。

  2.直接接種法

   ……

  混懸液等非澄清水溶性液體供試品、固體供試品、非水溶性供試品、敷料供試品、腸線、縫合線等供試品……。

  滅菌醫用器械供試品 除另有規定外，取規定量……。

  學習：增加了“除另有規定外”，有單獨批準的情況應照相應正文執行。

  放射性藥品……。

  培養及觀察

  將上述接種供試品后的培養基容器分別按各培養基規定的溫度培養不少于14天；接種生物制品的硫乙醇酸鹽流體培養基的容器應分成兩等份，??一份置30~35°C培養，一份置20～25℃培養。培養期間應定期觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液不少于1ml轉種至同種新鮮培養基中，將原始培養物和新接種的培養基繼續培養不少于4天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁；或取培養液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

  學習：取消了“逐日觀察”的規定，那問題是，隔幾天觀察一次呢…… 規定了疑??似培養液的最少轉種量，并且原始培養物和新接種的培養基繼續培養不少于4天（原來規定新轉種培養不少于3天?）。 “培養基出現渾濁，培養14天后”，作為時間操作，轉種或者直接鏡檢檢定，你更傾向于哪種呢？

 

  增加了一天，意味著檢驗周期應調整文14+4天。

  結果判斷

  若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生??長的微生物非供試品所含。只有符合下列至少一個條件時方可認為試驗無效：

  (1)無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。

  (2)回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。

  (3)在陰性對照中觀察到微生物生長。

  (4)供試品管中生長??的微生物經鑒定后，確證是因無?菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。 試驗若經評估確認無效后，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規?定。

 

  學習：原15版?中此節“陽性對照管應生長良好”刪除，“在陰性對照中觀察到微生物生長”放在后文“試驗無效”的子集中。更具條理性。“重試時，重新取同量供試品”，注意理解，這不同于OOS的擴大調查。

  表1批出廠產品及生物制品的原液和半成品最少檢驗數量

  ……主表未變。

 

  注：若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那么表中的最少檢驗數量應增加相應倍數。

  學習：這個“附注”需要結合表3使用，同時注意“陽性對照”也需要同樣增加的問題。

  表2上市抽驗樣品的最少檢驗數量

  ……

  表3供試品的最少檢驗量

  注意：表3中，對于固體制劑，供試品裝量在50mg≤M＜3?00mg的范圍時，“每支供試?品接入每種培養基的最少量”為：半量，但不得少于50mg。

  本文轉載自微信公眾號蒲公英，作者：歪把子。

 

上一篇：DNA/DNA（雜交）同源性測定

下一篇：非無菌藥品微生物限度檢查的影響因素分析