(一)熔解溫度(Tm)法

1.菌株培養和收集

  （1）固體平板法：以菌懸液接種千平皿或克氏瓶的瓊脂??培養基上，培養基和培養條件選其菌最合適的。一般24h（生長慢的菌可延長；芽孢菌應縮短，控制在生孢之前）后，用0.15 mol/LNaCl與0.1 mol/LEDTA (pH8.0)緩沖液洗平板，收集菌體。

  （2）液體搖瓶法：接種斜面種子于裝有液??體培養基的三角瓶內，置200 r/min的搖床培養16-24h后?離心。以上述同樣的緩沖液洗細胞，最終溶于同樣的緩沖液中，濃度為2～3g濕細胞125 ml緩沖液。

2.DNA提取和純化

  （1）將上述培養液或細胞懸液離心收集細胞，并以TE緩沖液(10mmol/LTris-HC?I；1m mol/LEDTA, pH8.0)洗細胞，懸浮于50m mol/LTris-HCI—5 m mol/L EDTA (pH 8.0)緩沖液中。

&??nbsp; （2）加溶菌酶0.5-1 mg/ml（終濃度），置37℃水浴搖床30-60 min。

  （3）加SDS(20%）至終濃度2%, 60℃水浴10 min或更長。

  （4）加5 mol/LNaCI04至終濃度為1 mol/L。

  （5）加等體積氯仿－異戊醇(24:1 v/v)，振蕩10 min。

  （6）離心5000 r /min, 10 min。

  （7）吸取含DNA的上清水層，加2倍體積乙醇(95%）。

  （8）用玻璃棒卷出DNA絲。

 &??nbsp;（9）溶于0.1 SSC (0.1 SSC: 0.0??15 mol/LNaCl-0.0015 mol/L檸檬酸鈉）。

  （10）重復5～9步驟2～3次，視樣品含蛋白質量而定。

  （1?1）加終濃度為50 μg/ml的RN??A酶，（RNA酶在0.15 mol/LNaCl (pH 5.0)中80攝氏度預處理10 min,以除DNA酶）置37℃水浴搖床30 min。

  （12）加等體積氯仿－異戊醇搖10 min。

  （13）離心5000 r/min, 5 min。

  （14）吸取水相，加2倍體積乙醇(95%）。

  （15）用玻璃棒卷出DNA絲。

  （16）重復12-15直至無蛋白層。

  （17）加1 ml 3mol??/LNaA?C-0.001 mol/L EDTA pH 7.0。

  （18）邊攪邊加0.54倍體積的異丙醇。

 &nb?sp;（19）溶于O.lSSC。DNA純度檢查：O.D值230:260:280=0.454中0.515

3.Tm測定

  （1）儀器：帶加溫裝置的紫外分光光度計。

  （2）步驟：①心波長固定于260 nm；②將待測樣品用O.lSSC稀釋至OD260值于0.3～0.6??間；③在波長260 nm首先記錄25℃飛的吸光度(A25 )然后溫度迅速上升至50℃；④每隔3～5℃記錄一次；⑤OD值開始上升表示變性開始，每隔l℃穩定5 min,記錄杯內溫度和OD值，直至OD值不變表示變性完畢。

4.Tm值計算

  （1）熱變性溫度測定完成后，將記錄的溫度和相應光密度整理成表。

  （2）含各光密度乘相應溫度的相對膨脹系數(Vt)與25℃時光密度相比Vt??/V25,求得相對的光密度。

  （3）以溫度??為橫坐標，以相對光密度為縱坐標，繪制熱變性曲線。熱變性曲線中點相對應的溫度即為熔鏈溫度(??Tm值）。

5.G+C mol％含量計算

  0.1SSC:G+Cmol% =2.44Tm-69.3

  1SSC:G+Cmol% =2.08Tm-106.4

  注：必須以大腸埃希氏菌(E.coli K₁₂)為參比操作對照，以核實實驗誤差。

（二）浮力密度法

  在氯化銫(CsCI)中DNA的浮力密度（ρ）與它的G+C含量呈線性增長關系。當DNA分子在CsCl溶液中高速離心時，會在CsCl密度梯度形成的一定部位形成DNA帶。這個帶的DNA分子密度相當于這個部位的?CsCl的密度，這個帶中點的DNA??密度稱作為它的浮力密度(ρ)。

  稱固體CsCl 6.3 g溶于合適的緩沖液(0.05mol/LTris-HCl pH 7.3)調整到最終重置為10g,即密度約1.??700 g/cm 3,分別使1 ml C-sCl緩沖液含2-3 μgDNA和相同量 的標準DNA,重新調密度到1.700 g/cm 3,并用折射儀作簡單核算：1.700密度相當于折光指數1.3994。將溶液倒入10mm的單個分段杯放入離心機轉頭， 然后于分析超速離心機中逐漸加??速至45,000 r/min, 25℃離心20h。利用DNA對紫外吸收來確定未知DNA密度帶的位置和標準DNA密度帶的位置，求得它們與離心機中心的距離(r和r0)。

  利用公式：

  ρ= ρ_o + 0. 0092 (r²-r²₀），ρ0為標準DNA密度(E.coli的ρ_o為1.710 g/cm3 )。根據Schildkraut公式， 求出待測DNA的G+C含量：

  ρ= 1.66 + 0.098 (G+ C)

  本文節選自《常見細菌系統鑒定手冊》第十五章。

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